定量点印迹法估测组织裂解液中的靶蛋白

摘要

来源：Qi, X.，等。利用定量点印迹分析法（QDB）高通量绝对测定组织水平特定蛋白质含量。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种用于对组织样本中目标蛋白进行绝对定量的定量点印迹（QDB）技术。样本中的蛋白质被固定在QDB板微孔内的硝酸纤维素膜上。利用与目标蛋白特异性抗体偶联的过氧化物酶，催化化学发光底物发生氧化反应产生光信号，通过测量光强度来确定样本中蛋白质的浓度。

方案

1. 样品制备

1. 取50 mg小鼠组织放入1.5 mL离心管中。加入200 µL裂解缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.4，137 mM NaCl，5 mM EDTA，5 mM EGTA，1 mM MgCl₂，10 mM Na₂P₂O₇，1% Triton X-100，10%甘油），并添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂（100 mM NaF，0.1 mM苯甲基磺酰氟，5 µg/mL胃蛋白酶抑制剂，10 µg/mL亮抑酶肽，5 µg/mL抑肽酶）。
2. 在冰上使用匀浆器匀浆组织1分钟。
3. 在4 °C下以8,000 × g离心10分钟。
4. 将上清液转移至新的离心管（1.5 mL）中，并取1 µL使用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。
   注意： 所有常用于Western印迹分析和点印迹分析的裂解缓冲液均可用于QDB分析。

2. 确定抗体的特异性

1. 为进行蛋白质印迹分析，准备样品裂解液（20 µg，见第1.4节）、无IgG的牛血清白蛋白（20 µg）和标准蛋白（600 pg）。
   注意： 无IgG的牛血清白蛋白用作阴性对照，标准蛋白用作阳性对照。通过蛋白质印迹分析显示一条大小正确的特异性条带，可证明抗体的特异性。

3. 确定QDB分析的线性范围

1. 用ddH₂O溶解标准蛋白，将蛋白稀释至浓度为1,200 pg/µL。
2. 将第1.4节中制备样品的浓缩蛋白稀释至4 µg/µL。
3. 用ddH₂O溶解BSA，将蛋白分别稀释至1,200 pg/µL和4 µg/µL的浓度。
4. 根据 表1 和 表2的指导，制备一系列标准蛋白和制备样品的稀释液。
5. 取10 µL稀释后的标准蛋白或稀释后的制备样品，与10 µL 2x上样缓冲液（120 mM Tris-HCl pH 6.8，20%甘油，4% SDS，0.2%溴酚蓝，200 mM DTT）混合。
6. 将混合物在85 °C加热5分钟。

4. QDB 分析流程

1. 样品应用
   1. 支撑 QDB 板，避免板底部接触台面。例如，可使用空的移液器吸头盒作为支撑。
   2. 将最多 2 µL 的样品加至 QDB 板各单元底部膜的中心位置。
2. 干燥板
   1. 将加样后的 QDB 板在室温（RT）下放置 1 小时，或在通风良好的环境中于 37 °C 下放置 15 分钟。
3. 封闭板
   1. 将 QDB 板浸入转移缓冲液（0.039 M 甘氨酸，0.048 M Tris，0.37% SDS，20% 甲醇）中，并轻轻振荡 10 秒。
   2. 用 TBST（Tris 缓冲盐水，0.1% Tween 20）轻轻冲洗 QDB 板三次，然后在持续振荡下用 TBST 洗涤 5 分钟。
   3. 用封闭缓冲液（TBST 中含 5% 脱脂奶粉，每孔 100 µL）在持续振荡条件下封闭 QDB 板 1 小时。
4. 一抗孵育
   1. 将一抗用封闭缓冲液按选定浓度（1:500 至 1:5,000）稀释，每孔加入 100 µL 至普通 96 孔板的各个孔中。将 QDB 板插入 96 孔板中，在持续振荡条件下于室温孵育 2 小时，或于 4 °C 过夜孵育。
   2. 或者，将 QDB 板放入一个盒子中，若整块板使用同一种抗体，则加入封闭缓冲液至液面高出膜部分 2 至 3 mm。加入选定浓度的一抗，在持续振荡条件下于室温孵育 2 小时，或于 4 °C 过夜孵育。
   3. 孵育后，先用 TBST 轻轻冲洗板三次，再在持续振荡条件下每次用 TBST 洗涤 5 分钟，共洗涤三次。
5. 二抗孵育
   1. 将二抗用封闭缓冲液按选定浓度（1:1,000 至 1:50,000）稀释，按每孔 100 µL 分装至 96 孔板中，或如 4.4.2 节所述置于盒子中，然后将 QDB 板放入已加样的 96 孔板或盒子中，在持续振荡条件下于室温孵育 1 小时。
   2. 用 TBST 轻轻冲洗 QDB 板三次，然后在持续振荡条件下每次用 TBST 洗涤 5 分钟，共洗涤三次。
6. 定量分析
   1. 按照生产商说明书配制增强型化学发光底物（ECL）。
   2. 将 ECL 底物分装至 96 孔板中（每孔 100 µL），将 QDB 板插入 96 孔板中，在持续振荡条件下孵育 2 分钟。
   3. 将 QDB 板从 96 孔板中取出，短暂振摇以去除多余液体，然后将板置于白色微孔板上。
   4. 打开微孔板读数仪，在用户界面中选择“带盖板”选项，然后将组合板（QDB 板 + 白色板适配器）放入微孔板读数仪中进行定量。
      注意： 务必使用白色不透明微孔板作为适配器，以避免任何来自板的干扰。务必选择“带盖板”选项，以防止组合板（QDB 板 + 96 孔板适配器）放入微孔板读数仪时卡住仪器。

表1. 标准蛋白曲线的稀释方案。

	S1 (0 pg/µl)	S2 (33.3 pg/µl)	S3 (100 pg/µl)	S3 (300 pg/µl)	S5 (600 pg/µl)	S6 (1200 pg/µl)
标准蛋白 (1200 pg/µl)	0	1.39	4.17	12.5	25	50
IgG-free BSA (4 pg/µl)	50	48.61	45.83	37.5	25	0
总量	50	50	50	50	50	50

表2. 制备样品的稀释方案

	X1 (0 µg/µl)	X2 (0.25 µg/µl)	X3 (0.5 µg/µl)	X4 (1 µg/µl)	X5  (2 µg/µl)	X6  (4 µg/µl)
样品 (4 µg/µl)	0	3.125	6.25	12.5	25	50
无IgG的BSA (4 µg/µl)	50	46.875	43.75	37.5	25	0
总量	50	50	50	50	50	50

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酶标仪	Tecan	Tecan Infinite 200 PRO
QDB 板	烟台泽斯特尔有限公司		如需验证用途，可通过电子邮件或访问 www.zestern.net 网站申请获取该板。
辣根过氧化物酶标记驴抗兔 IgG (H+L) 抗体（最小交叉反应：牛、鸡、山羊、豚鼠、叙利亚仓鼠、马、人、小鼠、大鼠、绵羊血清蛋白）	Jackson	711-035-152
增强型化学发光底物	Thermo	32134
兔抗 CAPG 抗体	义翘神州公司	14213-T52
CAPG 蛋白	义翘神州公司	14213-HNAE
HEPES	Sigma	H4034
NaCl	天津瑞吉金特种化学有限公司	10461220
MgCl2	天津致远化学试剂有限公司	20120802
EDTA	Sigma	E9884-500G
EGTA	Sigma	BNN1913
Na2P2O7	海拓中药检测	20160914
Triton X-100	Sigma	T9284
甘油	Sigma	G7757
苯甲基磺酰氟	Sigma	P7626-5G
胃蛋白酶抑制剂	Sigma	Z290033
亮抑蛋白酶肽	Sigma	L2884
抑肽酶	Sigma	A3428
Tris-HCl	Sigma	T6455
SDS	Sigma	L5750-500G
DTT	Sigma	43815-1G
溴酚蓝	Sigma	B-0126
NaF	Sigma	S7920