定量点印迹法估测组织裂解液中的靶蛋白

摘要

来源：Qi, X.，等。利用定量点印迹分析法（QDB）高通量绝对测定组织水平特定蛋白质含量。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种用于对组织样本中目标蛋白进行绝对定量的定量点印迹（QDB）技术。样本中的蛋白质被固定在QDB板微孔内的硝酸纤维素膜上。利用与目标蛋白特异性抗体偶联的过氧化物酶，催化化学发光底物发生氧化反应产生光信号，通过测量光强度来确定样本中蛋白质的浓度。

方案

1. 样品制备

1. 取50 mg小鼠组织放入1.5 mL离心管中。加入200 µL裂解缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.4，137 mM NaCl，5 mM EDTA，5 mM EGTA，1 mM MgCl₂，10 mM Na₂P₂O₇，1% Triton X-100，10%甘油），并添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂（100 mM NaF，0.1 mM苯甲基磺酰氟，5 µg/mL胃蛋白酶抑制剂，10 µg/mL亮抑酶肽，5 µg/mL抑肽酶）。
2. 在冰上使用匀浆器匀浆组织1分钟。
3. 在4 °C下以8,000 × g离心10分钟。
4. 将上清液转移至新的离心管（1.5 mL）中，并取1 µL使用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。
   注意： 所有常用于Western印迹分析和点印迹分析的裂解缓冲液均可用于QDB分析。

2. 确定抗体的特异性

1. 为进行蛋白质印迹分析，准备样品裂解液（20 µg，见第1.4节）、无IgG的牛血清白蛋白（20 µg）和标准蛋白（600 pg）。
   注意： 无IgG的牛血清白蛋白用作阴性对照，标准蛋白用作阳性对照。通过蛋白质印迹分析显示一....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酶标仪	Tecan	Tecan Infinite 200 PRO
QDB 板	烟台泽斯特尔有限公司		如需验证用途，可通过电子邮件或访问 www.zestern.net 网站申请获取该板。
辣根过氧化物酶标记驴抗兔 IgG (H+L) 抗体（最小交叉反应：牛、鸡、山羊、豚鼠、叙利亚仓鼠、马、人、小鼠、大鼠、绵羊血清蛋白）	Jackson	711-035-152
增强型化学发光底物	Thermo	32134
兔抗 CAPG 抗体	义翘神州公司	14213-T52
CAPG 蛋白	义翘神州公司	14213-HNAE
HEPES	Sigma	H4034
NaCl	天津瑞吉金特种化学有限公司	10461220
MgCl2	天津致远化学试剂有限公司	20120802
EDTA	Sigma	E9884-500G
EGTA	Sigma	BNN1913
Na2P2O7	海拓中药检测	20160914
Triton X-100	Sigma	T9284
甘油	Sigma	G7757
苯甲基磺酰氟	Sigma	P7626-5G
胃蛋白酶抑制剂	Sigma	Z290033
亮抑蛋白酶肽	Sigma	L2884
抑肽酶	Sigma	A3428
Tris-HCl	Sigma	T6455
SDS	Sigma	L5750-500G
DTT	Sigma	43815-1G
溴酚蓝	Sigma	B-0126
NaF	Sigma	S7920