定量 Western 印迹法检测蛋白质表达水平

摘要

来源：Huang, Y. T.，等。利用标准化定量蛋白质印迹法在不同组织及发育过程中进行蛋白质水平的稳健比较。J. Vis. Exp. (2019)。

该视频展示了一种基于总蛋白归一化的蛋白质印迹技术，用于定量样品中目标蛋白的表达水平。通过利用样品的总蛋白染色，进行比率分析以确定目标蛋白的相对表达水平。

方案

注意：本实验方案已采用标准化的市售试剂盒和试剂进行优化，以提高可重复性（见材料表）。

1. 样品制备

1. 蛋白质提取
   1. 将-80 °C保存的速冻细胞或组织样品置于干冰上转移，冰上解冻，并根据需要使用预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。避免不必要的冻融循环，以免影响蛋白质质量。
   2. 向每个样品中加入含有1×蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液（25 mM Tris-HCl（pH 7.6）、150 mM NaCl、1% NP-40、1% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS），根据组织重量使用最适体积。
      注意：根据具体应用，匀浆缓冲液的类型和用量可能需要进一步优化。
   3. 使用带有聚丙烯杵头的手持式电动匀浆器匀浆组织样品。每次处理不同样品之间，用双蒸水清洗杵头，并用洁净纸巾擦干。在不同实验条件或不同组织之间应更换杵头。
   4. 匀浆后将样品置于冰上静置10分钟。在4 °C下以>10,000 × g离心10分钟。
   5. 将上清液小心转移至冰上的新离心管中，避免扰动沉淀。上清液即为蛋白质样品。提取的蛋白质可储存于-80 °C，或直接用于测定蛋白浓度。
2. 蛋白质浓度的定量与归一化
   1. 使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白质浓度。按照制造商说明，在96孔光学板中配制BCA工作液，每孔加入200 µL BCA混合液。
      注意：其他定量方法如Lowry法和Bradford法也可用于测定蛋白质浓度，前提是实验间蛋白质浓度测定方法保持一致。
   2. 制备浓度梯度的牛血清白蛋白（BSA）标准品，每个浓度设三个复孔；每个蛋白质样品取1 µL，设两个复孔。将96孔板置于预热至60 °C的金属浴中孵育10分钟，若预期蛋白浓度较低，可适当延长孵育时间。
   3. 孵育结束后，使用酶标仪在560 nm波长处测定吸光度。
   4. 导出酶标仪读数，通过将各样品的平均吸光度值与标准曲线比较，计算蛋白质浓度。标准曲线的R²值应大于或等于0.98，以确保样品蛋白质浓度估算的准确性。
   5. 通过在样品缓冲液和超纯水中稀释蛋白质样品，对蛋白量进行归一化处理。总体积可根据所用凝胶类型进行调整。建议每泳道上样量为30 µg蛋白质作为起始量。根据需要向各样品中加入还原剂，如二硫苏糖醇（DTT；终浓度5 mM）或β-巯基乙醇（终浓度200 mM）。β-巯基乙醇应在通风橱中用移液器直接取用未稀释原液。
   6. 将样品在70 °C金属浴中孵育10分钟。孵育后立即置于冰上，涡旋混匀并短暂离心收集。保持冰上保存直至上样至凝胶。

2. 蛋白质样品的凝胶电泳

1. 设备与凝胶准备
   1. 在凝胶电泳装置系统中安装预制的4–12% Bis-Tris梯度凝胶（参见材料表）。使用前用双蒸水冲洗凝胶。
      注意：根据目标蛋白的大小、相互作用及丰度，可选用不同梯度、缓冲剂或不同孔数与孔径的凝胶。
   2. 每槽加入500 mL用双蒸水稀释的1x MES SDS电泳缓冲液。加入运行缓冲液后，小心从凝胶中取出梳子，避免破坏浓缩胶中的加样孔。
2. 蛋白上样
   1. 将3.5 µL蛋白标准品加入加样孔中。根据样品排布情况，在凝胶两侧均加载蛋白ladder有助于更准确地估计蛋白大小。使用细尖端的上样吸头可实现更精确的样品加载。
   2. 若使用内参标准进行膜间归一化（见下文步骤5及讨论部分），请在蛋白ladder旁边的前3个加样孔中加载与其他样品等量的内参标准品。
   3. 在其余加样孔中各加载30 µg样品。所有空孔中加入1x上样缓冲液。
3. 电泳
   1. 样品加载完成后组装电泳槽。先以80 V电压运行10分钟使样品通过浓缩胶，随后以150 V电压继续电泳45–60分钟。

3. 蛋白质转移

注意：本实验方案中的蛋白质转膜步骤采用市售的半干式转印系统（见材料表），以实现快速且稳定的转印效果。

1. 准备蛋白转印：将滤纸浸入双蒸水中预湿，并确保胶片刀、塑料巴斯德吸管、转印滚轮和镊子已准备好待用。
2. 小心移除转印夹层外层的包裹铝箔以打开转印夹层。取下底部玻璃板并放置一旁。用几滴电泳运行缓冲液（2–3 mL）迅速润湿底部玻璃板上的PVDF膜。一旦打开转印夹层，必须防止PVDF膜干燥。
3. 停止电泳后，使用胶片刀打开预制胶，切去浓缩胶部分。沿凝胶边缘切割，使其脱离塑料胶板。保持胶片刀湿润，以避免损伤凝胶。
4. 自下而上组装转印夹层：底部玻璃板（含PVDF膜）、蛋白凝胶和滤纸。使用转印滚轮彻底去除所有气泡。将顶部玻璃板置于滤纸上，再次滚动以排除气泡。切勿用力过猛，以免导致凝胶在蛋白转印过程中变形。
5. 将整个夹层放入转印装置中，电极置于装置左侧，并将凝胶海绵放置在夹层顶部，使其与装置上的相应电极接触点对齐。盖上盖子，选择并启动合适的程序（建议起始条件为20 V持续7分钟）。
6. 转印完成后，保持盖子关闭2分钟，使夹层冷却并防止膜干燥。取出转印夹层，将膜裁剪至与凝胶相同大小。在进行总蛋白染色前，用双蒸水快速清洗裁剪后的膜。

4. 总蛋白染色

注意：与更传统的检测方法（如化学发光检测）相比，使用荧光检测具有显著优势，因为其线性范围和灵敏度可以得到更好的控制。因此，在步骤4和5中使用荧光TPS和荧光二抗（见材料表）。

1. 将膜卷成50 mL离心管，使蛋白质面朝内。由于荧光TPS和二抗对光敏感，后续所有步骤均需在避光条件下进行。
2. 加入5 mL蛋白染色液（见材料表），在室温下于摇床上孵育5分钟。由于TPS和洗涤缓冲液含有甲醇，这些步骤应在通风橱中操作。
3. 弃去染色液，用5 mL洗涤液（含30%甲醇的6.3%乙酸溶液）快速洗涤两次。每次洗涤之间将离心管短暂放回摇床。继续实验前，用超纯水短暂冲洗膜。

5. 封闭、抗体孵育与检测

1. 封闭膜：向含有膜的50 mL离心管中加入3 mL封闭缓冲液（见材料表）。在室温下于摇床上孵育30分钟。根据所选抗体的不同，可能需要优化封闭缓冲液的类型。
2. 一抗孵育
   1. 弃去封闭缓冲液，加入适当且已优化浓度的一抗（图1和图2：小鼠抗SMN抗体，1:1,000稀释于封闭缓冲液中）。
      注意：一抗的充分优化应包括确认该抗体可检测到正确大小的蛋白产物，同时对其他非特异性蛋白产物无结合或结合极少。如有可能，应对针对目标蛋白的多种抗体进行测试和比较。
   2. 在4 °C下于摇床上孵育过夜。次日，移除抗体溶液，并在室温下用1× PBS在摇床上洗涤6次，每次5分钟。
3. 二抗孵育
   1. 将特异性二抗按1:5,000的比例用5 mL封闭缓冲液稀释，该二抗应针对一抗的宿主种属。其他二抗可能需要不同的稀释比例或使用不同的封闭缓冲液。
   2. 在室温下于摇床上用二抗溶液孵育膜1小时。孵育后，在摇床上用1× PBS洗涤3次，每次30分钟。
   3. 将膜干燥，并用铝箔包裹以避光保存，直至进行检测。膜可长期保存于4 °C。
4. 图像采集
   1. 登录连接扫描仪的计算机。将膜放置在扫描仪上，使蛋白面朝下，并在软件中选择扫描区域。
   2. 通过确认无信号饱和，优化两个通道（700 nm和800 nm）的激光强度。采集两个通道的图像，并导出图像用于后续分析（步骤6）。

6. 蛋白质印迹分析与定量

注意：这些推荐基于免费提供的 Image Studio 软件。然而，也可使用其他软件包（如 ImageJ）进行类似的分析。

1. 导入文件在用于分析的计算机上创建本地工作区。这将为获取的 Western 印迹图像文件生成一个数据库。导入扫描仪获得的文件，并选择用于分析的图像。
2. TPS 分析
   1. 显示 700 nm 通道以展示总蛋白染色结果。文中包含一个 TPS 图像示例。 图1 其中来自新生期（P5）的不同的组织（图 1A-B）以及10周龄小鼠（图1C-D）进行直接比较。同样地， 图2 展示了不同年龄小鼠脑组织的直接比较示例。
   2. 选择 分析 从右上角的标签中选择 添加矩形 用于定义归一化的感兴趣区域（图1B, D）。复制并粘贴第一个矩形区域到每个单独的样本上，以确保所有分析泳道的定义区域大小一致。
   3. 从结果中复制 形状 软件左下角的标签
3. 定量分析
   注意： 定量样本的最佳方法取决于实验设计。本文将通过一个示例说明如何检测存活运动神经元蛋白（Smn；一种与神经肌肉疾病脊髓性肌萎缩症相关的关键蛋白），该蛋白已知会随时间推移而减少，并阐述将Smn信号强度归一化至TPS如何提供对蛋白表达动态的可靠估计。
   1. 图2 显示随着动物年龄增长，Smn 表达量下降，以 TPS 作为蛋白质上样对照。重复步骤 6.2.1–6.2.3 以定量蛋白质上样量图2B）。在800 nm通道中重复步骤6.2.1-6.2.3（图2A）以分析目标蛋白。
   2. 将 TPS 和目标蛋白的结果复制到电子表格程序中。在电子表格中，首先通过确定最高的 TPS 信号值，并将每个 TPS 信号值除以该最大值，从而计算出归一化的蛋白上样量。
   3. 将每个样本的800 nm信号值除以其对应的归一化蛋白值，以计算不同样本中的相对蛋白表达比率。
   4. 第一次归一化后，将不同时间点或组织与内参标准的平均值进行比较，以实现不同膜和不同实验间的直接比较。

结果

图 1. Western blot 显示小鼠在两个不同年龄阶段组织中 TPS 和 Smn 蛋白水平。 P5（A）和 10 周龄（C）小鼠的 TPS 和 Smn 蛋白表达。（B, D）全泳道 TPS 的荧光强度经计算后标示（以任意单位表示）。M：蛋白 Marker/标准蛋白；kDa：千道尔顿；a.u.：任意单位；P5：出生后第 5 天；10W：10 周。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细尖凝胶上样吸头	Alpha Laboratories	GL20057SNTL
Halt 蛋白酶抑制剂混合物，无 EDTA，100 倍，5 mL	ThermoFisher Scientific	78437
手持式匀浆器 	VWR Collection	431-0100
iBlot 2 蛋白质转膜装置	ThermoFisher Scientific	IB21001
iBlot 转膜套装，PVDF 膜，标准尺寸	ThermoFisher Scientific	IB401031
Image Studio Lite	Licor	N/A	可从 https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ 免费下载
IRDye 800CW 二抗	Licor	--	选择针对一抗宿主物种的合适二抗。
Micro BCA 蛋白定量检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	23235
Novex Sharp 预染蛋白质分子量标准	ThermoFisher Scientific	LC5800
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶，1.0 mm，15 孔	ThermoFisher Scientific	NP0323BOX
NuPAGE LDS 上样缓冲液 (4X)	ThermoFisher Scientific	NP0007
NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液 (20X)	ThermoFisher Scientific	NP0001
Odyssey 封闭缓冲液	Licor	927-40000
纯化小鼠抗 SMN（运动神经元存活蛋白）单克隆抗体	BD Transduction Laboratories	610646	在 SMN/SMA 相关文献中广泛应用，不同批次结果一致
REVERT 总蛋白染色液，250 mL 	Licor	926-11021 
REVERT 洗涤液 	Licor	926-11012 
RIPA 裂解与提取缓冲液	ThermoFisher Scientific	89900
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher Scientific	EI0001