单细胞西部印迹法测定细胞异质性

摘要

来源：Wang, L., 等，体内单核细胞趋化活性的定量分析及血液单核细胞来源巨噬细胞的表征。J. Vis. Exp. (2019)。

该视频介绍了一种单细胞Western印迹技术，可鉴定捕获于单细胞Western印迹芯片上的异质悬浮液中单个细胞的组成。该技术通过检测与目标细胞特异性蛋白标志物相连的荧光染料的荧光强度来实现分析。

方案

1. 使用单细胞Western印迹（scWB）分析确定细胞悬液中的细胞组成

1. 使用前，将scWB芯片置于培养皿中，加入15 mL 1×悬浮缓冲液，在室温下水化至少10分钟。
2. 向已水化的芯片中加入1 mL稀释后的单细胞悬液（10,000–100,000 个细胞/mL）。将芯片表面置于10 cm培养皿底部，确保其平整放置。
3. 用培养皿盖盖住培养皿以防止干燥，并通过梯度作用使细胞沉降5–15分钟。
4. 将芯片置于明场显微镜下，以10倍物镜观察微孔。
   注意：约15–20%的微孔应含有单个细胞，含两个或以上细胞的微孔应少于2%。
5. 将含有芯片的10 cm培养皿倾斜45度。
6. 用1×悬浮缓冲液轻轻从芯片顶部向底部移液，清洗芯片表面以去除未被捕获的细胞，重复3次。
7. 准备单细胞Western仪器。
8. 设置裂解时间、电泳时间和紫外捕获时间。若要分析从基底膜来源凝胶塞中回收的募集巨噬细胞，请使用以下参数：裂解时间：0 s；电泳时间：160 s；紫外捕获时间：240 s。
9. 小心将芯片装入单细胞Western仪器的电泳槽中，凝胶面朝向仪器。注意避免损伤芯片的凝胶面。
10. 向电泳槽中加入裂解/电泳缓冲液，完全覆盖整个单细胞Western芯片，启动细胞裂解程序。
11. 按照步骤1.8中列出的设置运行scWB仪器。
12. 运行完成后，将芯片转移至10 cm培养皿中，用1×洗涤缓冲液在室温下洗涤2次，每次10分钟。
13. 在80 µL抗体稀释液中配制一抗稀释液（抗vinculin：1:10；抗CD45：1:15；抗CD11b：1:20；抗F4/80：1:10）（混合8 µL一抗1 + 8 µL一抗2 + 64 µL稀释液）。
14. 向抗体孵育室中加入80 µL一抗溶液，并将芯片凝胶面朝下放置，使抗体溶液沿芯片毛细扩散。
15. 在室温下避光孵育一抗溶液2小时。
16. 在摇床上用1×洗涤缓冲液洗涤芯片3次，每次10分钟。
17. 在摇床上用去离子水洗涤芯片1次，每次10分钟，以去除凝胶中的盐分。
18. 在80 µL总体积中配制1:20稀释的二抗溶液（混合2 µL二抗 + 78 µL稀释液）。
19. 在室温下避光孵育二抗1小时。
20. 在摇床上用1×洗涤缓冲液洗涤芯片3次，每次10分钟。
21. 使用载玻片离心机旋转芯片，去除残留的洗涤缓冲液。
22. 使用双激光微阵列扫描仪，在5 µm分辨率下，针对与二抗偶联的荧光染料的光谱通道扫描芯片。
23. 使用scWB专用软件分析数据。

2. 剥离 scWB 芯片

1. 将扫描后的芯片保存在洗涤缓冲液中，直至准备进行剥离。
2. 将水浴锅置于通风橱内。
3. 将一个50 mL试管架放入水浴锅中，加水至水面高出试管架约1 cm，并将水温设定为60 °C。
4. 配制剥离缓冲液。取900 mL去离子水，溶解9.85 g Tris-HCl（pH 6.8）和20 g SDS，调节pH值后定容至1 L。每次使用前立即加入0.8%（v/v）的β-巯基乙醇（β-ME；14.3 M）。
5. 完成初次扫描后，将芯片放入一个10 cm的培养皿中，准备进行剥离处理。
6. 每张芯片取40 mL剥离缓冲液，并加入320 µL β-ME。
   注意：β-ME具有毒性，对人类和环境有害。以下操作应在通风橱中进行。
7. 将芯片放入容器中，并用封口膜密封容器，防止水渗入容器内。
8. 将密封好的容器放入预热的水浴锅中的试管架内。
9. 孵育90分钟。
10. 小心地从容器中取出芯片，并转移至一个新的培养皿中。
11. 用1×洗涤缓冲液短暂清洗芯片一次，然后向培养皿中加入15 mL 1×洗涤缓冲液。
12. 在摇床上清洗芯片15分钟，重复该洗涤步骤四次。
    注意：芯片现已准备好用于下一轮一抗孵育（参见步骤1.12–1.21）

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cm 培养皿	griner bio-one	664 160
10x 悬浮缓冲液	proteinsimple	R101
15 cm 培养皿	Falcon	353025
2-巯基乙醇	MP BIOMEDICALS	2194705
5% 洗涤缓冲液	proteinsimple	R252
抗体稀释液	proteinsimple	042-203
台式离心机	Beckman Coulter		Microfuge 22R 离心机
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906-100G
钙黄绿素 AM	ThermoFisher	C3099	1 mL
CD11b	Novus Biologicals	NB110-89474
CD45 (D4H7K) 兔单克隆抗体	Cell Signal Technologies	727987S
CD68/SR-D1 (FA-11)	Novus Biologicals	NBP2-33337SS
Cellometer Vision 细胞计数仪	Nexcelom
中性蛋白酶	BD	354235	100 mL
解剖剪
驴抗兔 IgG 二抗 [NL557]	Novus Biologicals	NL004	NL 557 偶联物
驴抗大鼠 IgG (H+L) 二抗 [DyLight 650]	Novus Biologicals	NBP1-75655	DyLight 650 偶联物
F4/80 (CI-A3-1)	Novus Biologicals	NB600-404SS
加热块	effendorf	22331	Thermomixer
裂解/运行缓冲液	proteinsimple	R200
Matrigel 基质（生长因子减少型）	BD	354230	10 ml
微阵列扫描仪	PerkinElmer	ScanArray Gx
微量离心管	Fisher Scientific	05-408-129
显微镜	ThermoFisher	Evos fl
Milo	proteinsimple		单细胞 Western
针头	BD	305111	26 G
封口膜
探针室	proteinsimple	035-020
重组小鼠 CCL2/JE/MCP-1 蛋白	R&D	479-JE-050
scWEST 芯片	proteinsimple	C300
摇床	Bioexpress		Gene mate 轨道摇床
单细胞 Western 芯片筒	proteinsimple	035-118
玻片旋转器	Labnet	C1303-T
十二烷基硫酸钠 (SDS)	Fisher Scientific	BP 166-500
注射器	BD	309602	1 mL
Tris-盐酸	Fisher Scientific	BP 153-500
镊子	proteinsimple	035-020
水浴锅	ThermoFisher