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化学发光Western印迹法检测蛋白质加工

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2025年7月8日

本文内容

摘要

来源：Hillert-Richter, L. K. 等，测定CD95死亡诱导信号复合物的组成及其复合物中前半胱天冬酶-8的加工过程。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频介绍了基于化学发光的免疫沉淀裂解液蛋白质印迹技术。该技术有助于确定蛋白质的加工和活化过程。所检测到的化学发光信号强度与蛋白质活化过程中的加工水平成正比。

方案

T细胞实验根据伦理协议42502-2-1273 Uni MD进行。

1. 实验前细胞的准备

注意： 本免疫沉淀实验的细胞平均数量为 1 × 107。贴壁细胞需在实验前一天接种，以确保实验当天细胞数量达到 1 × 107。

  1. 实验前准备贴壁细胞
    1. 实验开始前一天，在14.5 cm培养皿中每种条件加入20 mL培养基（培养基成分见材料表），接种5–8 × 106个贴壁细胞。
    2. 实验当天，确保细胞贴壁良好且融合度达到80–90%。弃去原培养基，为贴壁细胞更换新鲜培养基。
  2. 实验前准备悬浮细胞
    1. 实验开始前立即在14.5 cm培养皿中每种条件加入10 mL培养基（培养基成分见材料表），轻柔加入1 × 107个悬浮细胞。
    2. 若使用原代细胞，按照先前描述的方法分离原代T细胞。用1 µg/mL植物血凝素处理原代T细胞24小时，随后用25 U/mL IL2处理6天。
    3. 实验开始前立即在14.5 cm培养皿中每种条件加入10 mL培养基（培养基成分见材料表），轻柔加入1 × 108个原代T细胞。
      注意：建议使用较高数量的原代T细胞，因为这些细胞体积较小。

2. CD95L 刺激

  1. 用CD95L刺激细胞（可按先前所述方法制备或使用 commercially available 的CD95L（参见材料表）。
    注意：CD95L的浓度和刺激时间取决于细胞类型。每种刺激条件需设置两个平行样本，以同时生成“磁珠对照”样本。
    1. 用选定浓度的CD95L刺激贴壁细胞。将培养板倾斜，用移液器将配体加入培养基中，避免接触贴壁细胞。
    2. 通过将配体溶液加入细胞悬液中，用CD95L刺激悬浮细胞。

3. 细胞收获与裂解

  1. 将细胞培养皿置于冰上。
    注意：不要丢弃培养基。死亡的细胞会悬浮在培养基中，对后续分析至关重要。
  2. 向细胞悬液中加入 10 mL 冷的磷酸盐缓冲液（PBS），刮下贴壁细胞，并将细胞悬液收集至 50 mL 离心管中。
  3. 用 10 mL 冷 PBS 洗涤细胞培养皿两次，将洗涤液收集至同一 50 mL 离心管中。在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。
  4. 弃去上清液，用 1 mL 冷 PBS 重悬细胞沉淀，将细胞悬液转移至 1.5 mL 离心管中。
  5. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 1 mL 冷 PBS 重悬细胞沉淀。
  6. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 1 mL 裂解缓冲液（含 4% 蛋白酶抑制剂混合物）重悬细胞沉淀，冰上孵育 30 分钟。
  7. 在 4 °C 条件下，以最大转速（约 17,000 × g）离心 15 分钟。
  8. 将上清液（裂解液）转移至洁净离心管中，弃去沉淀。另取 50 µL 裂解液至其他离心管中，通过 Bradford 法测定蛋白浓度，并取相当于 25 µg 蛋白的裂解液加入样品管中。向样品管中加入上样缓冲液（缓冲液成分见材料表），作为裂解液对照样品，于 -20 °C 保存。

4. 免疫沉淀（IP）

  1. 向裂解液中加入 2 µL anti-APO-1 抗体和 10 µL protein A sepharose beads（按制造商推荐方法制备）。另取一管含有裂解液的样品（刺激样品），仅加入 10 µL beads，作为“bead control”。
    注意：处理 protein A sepharose beads 时，应使用宽口移液枪头，可通过剪切枪头末端或购买专用于免疫沉淀的特殊枪头实现。
  2. 将裂解液与抗体/protein A sepharose beads 混合物在 4 °C 轻柔混匀条件下孵育过夜。于 4 °C 以 500 × g 离心 4 分钟，收集 beads。弃去上清液，向 beads 中加入 1 mL 冷 PBS，重复洗涤至少三次。
  3. 弃去上清液。建议使用 50 µL Hamilton 注射器吸取 beads。

5. 蛋白质印迹

  1. 向珠子中加入 20 µL 4x 上样缓冲液（缓冲液成分见材料表），在 95 °C 下加热 10 分钟。将裂解液对照样品在 95 °C 下加热 5 分钟。
  2. 将裂解液、免疫沉淀样品（IP）以及蛋白标准品上样至 12.5% 的十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶（凝胶配制方法见材料表），以 80 V 恒定电压电泳运行。
  3. 将 SDS 凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜。
    注意：此处采用针对目标蛋白优化的半干转印法，转印时间为 12 分钟（25 V；2.5 A，恒流）。在进行 Western 印迹前，将硝酸纤维素膜和两组小型转印夹心结构浸泡于电泳缓冲液中数分钟（缓冲液成分见材料表，按制造商说明配制）。
  4. 将转印后的膜放入盒中，用封闭液（含 0.1% Tween-20 的 PBS（PBST）+ 5% 脱脂奶粉）在室温下封闭 1 小时，并在轻微振荡条件下孵育。
  5. 用 PBST 洗涤膜三次，每次 5 分钟。

6. 蛋白质印迹检测

  1. 按照指定稀释比例（见材料表）将第一抗体加入膜中，并在4 °C下轻轻振荡孵育过夜。
  2. 用PBST洗涤膜三次，每次5分钟。
  3. 将膜与20 mL二抗（按1:10,000比例稀释于PBST + 5%脱脂奶粉中）在室温下轻轻振荡孵育1小时。
  4. 用PBST洗涤膜三次，每次5分钟。
  5. 弃去PBST，向膜中加入约1 mL辣根过氧化物酶底物。
  6. 检测化学发光信号（见材料表）。
    注意：曝光时间和采集图像数量取决于细胞中蛋白含量以及所用抗体的特异性。每种用于检测的抗体均需通过实验经验确定最佳条件。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12.5% SDS 胶自制用于两块分离胶：3.28 mL 去离子 H2O，2.5 mL Tris（pH 8.8，1.5 M），4.06 mL 丙烯酰胺，100 µL 10% SDS，100 µL 10% APS，7.5 µL TEMED；用于两块浓缩胶：3.1 mL 去离子 H2O，1.25 mL Tris（pH 6.8，1.5 M），0.5 mL 丙烯酰胺，50 µL 10% SDS，25 µL 10% APS，7.5 µL TEMED
14.5 cm 细胞培养皿Greiner639160
丙烯酰胺Carl RothA124.1
带高回收率滤芯和宽孔口的气溶胶过滤移液吸头VWR46620-664（北美）或 732-0559（欧洲）用于将珠粒移液至裂解液中
用于将珠粒移液至裂解液中Sigma AldrichA2103稀释比例：PBST 中 1:4000 + NaN3 中 1:100
抗 APO-1 抗体本实验由 Prof. P. Krammer 提供，或可从 ENZO 购买ALX-805-038-C100仅用于免疫沉淀
抗 caspase-10 抗体BiozolMBL-M059-3稀释比例：PBST 中 1:1000 + NaN3 中 1:100
抗 caspase-3 抗体Cell signaling9662 S稀释比例：PBST 中 1:2000 + NaN3 中 1:100
抗 caspase-8 抗体 C15本实验由 Prof. P. Krammer 提供，或可从 ENZO 购买ALX-804-242-C100稀释比例：PBST 中 1:20 + NaN3 中 1:100
抗 CD95 抗体Santa Cruzsc-715稀释比例：PBST 中 1:2000 + NaN3 中 1:100
抗 c-FLIP NF6 抗体本实验由 Prof. P. Krammer 提供，或可从 ENZO 购买ALX-804-961-0100稀释比例：PBST 中 1:10 + NaN3 中 1:100
抗 FADD 1C4 抗体本实验由 Prof. P. Krammer 提供，或可从 ENZO 购买ADI-AAM-212-E稀释比例：PBST 中 1:10 + NaN3 中 1:100
抗 PARP 抗体Cell signaling9542稀释比例：PBST 中 1:1000 + NaN3 中 1:100
APSCarl Roth9592.3
β-巯基乙醇Carl Roth4227.2
Bradford 溶液 蛋白检测试剂浓缩液 450 mLBio Rad500-0006按制造商说明使用
CD95L本实验由 Prof. P. Krammer 提供，或可从 ENZO 购买ALX-522-020-C005
化学发光检测仪 Chem Doc XRS+Bio Rad
完全蛋白酶抑制剂混合物（PIC）Sigma AldrichALX-522-020-C005按制造商说明配制
DPBS（10x）不含 Ca、MgPAN BiotechP04-53500用 H2O 稀释 1:10，冷藏保存
电泳缓冲液自制10x 电泳缓冲液：60.6 g Tris，288 g 甘氨酸，20 g SDS，加 H2O 至 2 L，使用前稀释 1:10
甘氨酸Carl Roth3908.3
山羊抗小鼠 IgG1 HRPSouthernBiotech 1070-05稀释比例：PBST 中 1:10,000 + 5% 脱脂奶粉
山羊抗小鼠 IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05稀释比例：PBST 中 1:10,000 + 5% 脱脂奶粉
山羊抗兔 IgG-HRPSouthernBiotech4030-05稀释比例：PBST 中 1:10,000 + 5% 脱脂奶粉
人白细胞介素-2（hIL-2）Merckgroup/Roche11011456001用于 T 细胞活化
KClCarl Roth6781.2
KH2PO4Carl Roth3904.1
上样缓冲液 4x Laemmli 样品缓冲液，10 mLBio Rad161-0747按制造商说明配制
Luminata Forte Western HRP 底物MilliporeWBLUFO500
裂解缓冲液自制13.3 mL Tris-HCl（pH 7.4，1.5 M），27.5 mL NaCl（5 M），10 mL EDTA（2 mM），100 mL Triton X-100，加 H2O 至 960 mL
贴壁细胞培养基 DMEM F12（1:1）含稳定谷氨酰胺，2.438 g/LPAN BiotechP04-41154向培养基中添加 10% FCS、1% 青霉素-链霉素和 0.0001% 嘌呤霉素
原代 T 细胞培养基gibco by Life Technologie21875034向培养基中添加 10% FCS 和 1% 青霉素-链霉素
脱脂奶粉Carl RothT145.4
Na2HPO4Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBST自制20x PBST：230 g NaCl，8 g KCl，56.8 g Na2HPO4，8 g KH2PO4 版权 © 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com 第 3 页（共 3 页）20 mL Tween-20，加 H2O 至 2 L，使用前稀释 1:20
PBST + 5% 脱脂奶粉自制50 g 脱脂奶粉 + 1 L PBST
PHAThermo Fisher ScientificR30852801用于 T 细胞活化
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein 标准品 全蓝Bio Rad161-0373使用量为 3–5 µL
Protein A Sepharose CL-4B 珠粒Novodirect/ Th.GeyerGE 17-0780-01按制造商说明制备的亲和树脂珠粒
细胞刮刀VWR734-2602
SDSCarl Roth4360.2
摇床Heidolph
叠氮化钠Carl RothK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo 小型转膜套装Bio Rad170-4270按制造商说明使用
TransBlot Turbo 5x 转膜缓冲液Bio Rad10026938按制造商说明配制
TransBlot Turbo 小型硝酸纤维素膜Bio Rad170-4270按制造商说明使用
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974,1000

重印与许可

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Caspase 8 DISC SDS PAGE

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