Northern 杂交检测与定量植物组织总 RNA 提取物中的特异性 microRNA

摘要

来源：Tirumalai, V.，等。利用RNA印迹法检测与定量植物微小RNA。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们演示了Northern印迹技术，这是一种通过杂交来检测和定量从植物组织提取的总RNA中微小RNA（miRNA）的方法。

方案

1. 凝胶电泳

1. 停止预电泳，并在上样前清洗上样孔。
2. 将样品在 98 °C 下加热 1 分钟，然后使用毛细管尖头趁热将样品加入上样孔中。将尖头插入上样孔底部，使样品在孔中形成一层薄层。
3. 完成所有样品的上样，包括加入 RNA decade marker。
4. 以 80 V 电压电泳，直至溴酚蓝染料几乎完全迁移。在 15% 变性丙烯酰胺凝胶中，溴酚蓝的迁移位置相当于 10 bp。

2. 电印迹前的准备

1. 用 HB 铅笔在 N+ 尼龙膜的右上角做标记，并将其裁剪至与玻璃板相同的尺寸。
2. 将尼龙膜轻轻放置在无菌水表面，标记面朝向水面，预浸泡 15 分钟。
3. 将 4 张滤纸 I 裁剪成与纤维垫相同尺寸。
4. 将夹心盒的灰色面朝下放置于洁净托盘中，准备凝胶夹心结构。
5. 将纤维垫预先润湿后覆盖在夹心盒上，去除气泡。
6. 将一张滤纸在 1× TBE 中预湿后覆盖在纤维垫上，用塑料移液管轻轻滚压以去除气泡；再覆盖另一张预湿滤纸，并同样去除气泡。
7. 小心从电泳夹心中取出凝胶，将其放置在夹心结构上，确保第一个上样 RNA 样品位于右侧。
8. 将预浸泡的尼龙膜在 1× TBE 中轻轻浸润，标记面朝下覆盖在凝胶上，用滚压法去除气泡。
9. 取一张滤纸浸湿后覆盖在膜上，去除气泡；再取另一张滤纸浸湿后覆盖在夹心结构上，同样去除气泡。
10. 在夹心结构上方放置一块预湿的纤维垫，合紧夹心盒，完成夹心结构组装。
11. 将转印夹心盒放入转印装置中，加入 1× TBE（pH 8.2）至标记线处。
12. 在 10 V 条件下，4 °C 过夜进行转印。
13. 转印完成后，将湿润的膜置于纸张上，立即用 254 nm 紫外光（120,000 µjoules/cm²）交联 RNA 至膜上。交联后的印迹膜可在 4 °C 保存，用于后续杂交实验。

3. 放射性标记探针的制备

1. 设计一条与待检测的小RNA完全互补的探针。
2. 按照表1中提供的配方，将各组分混合，使用BRIT提供的ƳP32ATP在探针的5'端进行末端标记。
3. 将上述反应混合物在37 °C下孵育30分钟。
4. 根据生产商的说明书，使用Sephadex G-25柱将未标记的ƳP32ATP与探针分离。

4. 杂交印迹

1. 将交联后的印迹膜（RNA面朝上）放入杂交瓶中。
2. 充分混匀超敏杂交缓冲液，加入10 mL，并将印迹膜置于35 °C的杂交炉中旋转孵育。
3. 预杂交20分钟。
4. 从杂交炉中取出杂交瓶，轻轻将标记好的探针加入杂交缓冲液中。
5. 在35 °C下旋转杂交12小时。
6. 杂交完成后，小心将杂交液转移至15 mL离心管中，可于4 °C保存以备重复使用。
7. 加入2×SSC缓冲液加0.5% SDS，快速洗涤印迹膜2分钟以去除多余的杂交液，弃去溶液。
8. 用2×SSC缓冲液加0.5% SDS在35 °C下旋转孵育30分钟。
9. 再用0.5×SSC缓冲液加0.5% SDS在35 °C下旋转洗涤30分钟。
10. 将印迹膜放入杂交封片中，吸去多余缓冲液并密封。
11. 将封好的印迹膜置于暗盒中，与无放射性磷屏一起曝光过夜。
12. 使用生物分子成像仪检测杂交信号，并用适当的软件分析结果。

表1：配方表

缓冲液与溶液	配方	备注
10 X TBE	0.89M Tris 缓冲液	应使用乙酸将 pH 调至 8.2
	0.89M 硼酸
	30mM EDTA
凝胶混合液	15% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液，19:1	凝胶混合液中不应含有尿素结晶
	8M 尿素
	1X TBE
上样染料	0.05 %(w/v) 溴酚蓝	处理去离子甲酰胺时应格外小心
	0.05 %(w/v) 二甲苯青
	100 % 去离子甲酰胺
探针标记	PNK 缓冲液 (10X, 2 µL)	该混合物含有放射性分子，此步骤必须由经过培训的人员在放射性实验室中操作
	PNK 酶 (1 µL)
	寡核苷酸 (100 µM, 0.1 µL)
	ƳP32 ATP (4 µL)
洗涤缓冲液 - I	2X SSC
	0.5% (w/v) SDS
洗涤缓冲液 - II	0.5X SSC
	0.5% (w/v) SDS
剥离缓冲液 - I	0.5X SSC
	0.1% (w/v) SDS
剥离缓冲液 - II	0.1X SSC
	0.1% (w/v) SDS

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液	Sigma	A9926	化学试剂
过硫酸铵（APS）	BioRad	1610700	化学试剂
印迹滤纸	Whatman 印迹滤纸 I	1001-125	检测耗材
溴酚蓝	Sigma	B5525-5G	化学试剂
毛细管上样吸头	BioRad	2239915	塑料制品
去离子甲酰胺	Ambion	AM9342	化学试剂
加热金属块	Eppendorf	5350	设备
Hybond N+ 尼龙膜	GE	RPN203B	检测耗材
杂交瓶	Sigma	Z374792-1EA	塑料制品
杂交炉	Thermo Scientific	1211V79	设备
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）	Sigma	T7024-25ml	化学试剂
磷屏成像仪	GE-Typhoon 扫描仪	29187194	设备
磷屏成像仪屏和暗盒	GE healthcare	GE28-9564-75	设备
移液器	Gilson，型号：P20 和 P10	FA10002M, FA10003M	塑料制品
塑料移液管	Falcon	357550	塑料制品
聚丙烯酰胺凝胶电泳装置	BioRad	1658003EDU	设备
Sephadex G-25 层析柱	GE healthcare	27532501	设备
真空离心浓缩仪	Thermo Scientific	20-548-130	设备
微量离心机	Tarsons	1010	设备
T4 多核苷酸激酶（PNK）	NEB	M0201S	检测试剂
转印装置（Transblot）	BioRad	1703946	设备
ULTRAHyb 杂交缓冲液	Ambion	AM8670	检测试剂
尿素	Fischer Scientific	15985	化学试剂
紫外交联仪	UVP	CL-1000L	设备
涡旋振荡器	Tarsons	3020	设备
水浴锅	NEOLAB	D-8810	设备
二甲苯青	Sigma	X4126-10G	检测试剂