利用TIRF显微镜观察肌动蛋白与微管耦联动力学

摘要

来源：Henty-Ridilla, J.L., 可视化肌动蛋白与微管耦合动力学 体外 通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术。 视觉实验杂志. (2022)

本视频介绍了TIRF技术，这是一种基于全内反射显微镜的方法，用于观察肌动蛋白和微管聚合的动态过程。该方法能够实现对肌动蛋白与微管偶联动态的高分辨率实时成像，对于理解细胞间相互作用至关重要。

方案

1. 清洗盖玻片

注意：按照 Smith et al., 2013 的方法清洗（24 mm x 60 mm，#1.5）盖玻片。

1. 将盖玻片按顺序排列在塑料载片邮寄容器中。
2. 依次将盖玻片浸入以下溶液中，并分别超声处理30–60分钟，每更换一种溶液之间用ddH₂O冲洗10次：含一滴洗洁精的ddH₂O；0.1 M KOH。将盖玻片保存在100%乙醇中，可存放长达6个月。
   注意：切勿用手套外的手指接触玻璃表面，应使用镊子操作。

2. 使用 mPEG- 和生物素-PEG-硅烷包被已清洗的（24 mm x 60 mm，#1.5）盖玻片

注意：本方案专门使用生物素-链霉亲和素系统将肌动蛋白和微管定位在TIRF成像平面内。也可使用其他包被方法和系统（如抗体、聚-L-赖氨酸、NEM肌球蛋白等）。

1. 解冻 PEG-硅烷和生物素-PEG-硅烷粉末的分装样品。
2. 使用前，将 PEG 粉末溶解于 80% 乙醇（pH 2.0）中，配制成终浓度为 10 mg/mL 的 mPEG-硅烷和 2–4 mg/mL 的生物素-PEG-硅烷的包被储备液。
   注意： PEG 粉末在宏观上看似已溶解，但在微观层面可能尚未完全溶解。正确重悬需持续吹打约 1–2 分钟。建议在粉末外观上完全溶解后，再额外吹打 10 次。
   注意： 配制 80% 乙醇（pH 2.0）时，因涉及浓盐酸，操作中需佩戴手套以保护皮肤。
3. 用镊子从乙醇储存液中取出洁净的（24 mm × 60 mm，#1.5）盖玻片，用氮气吹干，并存放于洁净的培养皿中。
4. 用 100 µL 包被溶液对盖玻片进行包被：该溶液为 80% 乙醇（pH 2.0）中含 2 mg/mL mPEG-硅烷（分子量 2,000）和 0.04 mg/mL 生物素-PEG-硅烷（分子量 3,400）的混合液。
   注意： 如需稀疏包被（推荐），使用 2 mg/mL mPEG-硅烷和 0.04 mg/mL 生物素-PEG-硅烷；如需致密包被，则使用 2 mg/mL mPEG-硅烷和 4 mg/mL 生物素-PEG-硅烷。
5. 将盖玻片在 70 °C 下孵育至少 18 小时，或孵育至使用前。
   注意： 包被后的盖玻片若在 70 °C 下储存超过 2 周，性能会下降。

3. 组装成像流室

1. 将双面背胶胶带裁剪成12条，每条长度为24 mm。撕去胶带一侧的背衬，将胶带条紧邻固定在洁净成像腔室的六个凹槽旁。
   注意：胶带必须平整，以确保正确组装，否则成像腔室会发生泄漏。应小心撕去胶带背衬，避免产生凸起。建议将贴好胶带的腔室在洁净表面上轻轻滑动，以使胶带与腔室接触更平整。
2. 撕去胶带第二层背衬，暴露每个成像腔室凹槽处胶带的粘性面。将腔室胶带面朝上放置于洁净表面上。
3. 按1:1比例（或根据制造商说明）在小型称量皿中混合环氧树脂与固化剂溶液。
4. 使用P1000移液器吸头，在每个成像腔室凹槽末端的胶带条之间滴加一滴混合好的环氧树脂（红色箭头；图1A）。将带有胶带和环氧树脂的一面朝上，放置于洁净表面上。
5. 从70 °C培养箱中取出一张已包被的盖玻片。用ddH₂O反复冲洗包被面和未包被面六次，用过滤氮气吹干，然后将盖玻片包被面朝向胶带，贴附到成像腔室上。
6. 使用P200或P1000移液器吸头在胶带与玻璃的界面处施加压力，以确保胶带与盖玻片之间形成良好密封。
   注意：密封良好时，双面胶带会变为半透明。若胶带与腔室接触不充分，则会导致泄漏。
7. 将组装好的腔室在室温下孵育至少5–10分钟，使环氧树脂充分固化，密封腔室孔洞后再使用。灌流腔室在组装后12–18小时内失效。
   注意：根据胶带位置及所用双面胶带的厚度，组装后的腔室最终体积为20–50 µL。

4. 灌注室的预处理

1. 使用灌注泵（流速设定为 500 µL/min）按以下顺序在灌注腔室中依次更换预处理溶液：
   1. 注入 50 µL 的 1% BSA 以预润成像腔室。从鲁尔锁接头储液池中移除多余的缓冲液。
   2. 注入 50 µL 的 0.005 mg/mL 链霉亲和素。室温孵育 1–2 分钟。从储液池中移除多余的缓冲液。
   3. 注入 50 µL 的 1% BSA 以封闭非特异性结合位点。孵育 10–30 秒。从储液池中移除多余的缓冲液。
   4. 注入 50 µL 温热（37 °C）的 1× TIRF 缓冲液（1× BRB80、50 mM KCl、10 mM DTT、40 mM 葡萄糖、0.25% (v/v) 甲基纤维素（4,000 cp））。
      注意：不要从储液池中移除多余的缓冲液。这可以防止腔室干燥，避免向系统中引入气泡。
   5. 可选：注入 50 µL 用 1× TIRF 缓冲液稀释的稳定化且 50% 生物素化的微管种子溶液。
      注意：合适的稀释比例需通过实验确定，且存在批间差异。在此实验装置中，每视野出现 10–30 个种子的稀释比例效果良好。

5. 显微镜准备

注意： 使用配备120-150 mW固态激光器、温度校正的63倍油浸TIRF物镜和EMCCD相机的倒置全内反射荧光（TIRF）显微镜，对含有动态肌动蛋白丝和微管的生化反应进行可视化或实验观察。本示例中蛋白质在以下波长下进行观察：488 nm（微管）和647 nm（肌动蛋白）。

1. 在对第一个生化反应进行成像前至少30分钟，将载物台/样品加热装置设定为维持35–37 °C。
2. 设置图像采集参数如下：
   1. 将采集间隔设置为每5秒一次，持续15–20分钟。
   2. 将488 nm和647 nm激光的曝光时间设为50–100 ms，功率设为5%–10%。为显微镜设置合适的全内反射角（TIRF角）。
      注意： 无论显微镜配置如何，设置激光功率、曝光时间和TIRF角的最简单方法是基于单一聚合物的图像进行调整（见下文5.2.2.1和5.2.2.2）。强烈建议使用者采用能够保证检测到信号的最低激光功率和最短曝光时间。
      1. 调节聚合反应（图1C），以启动肌动蛋白丝的组装，并在647 nm波长下采集图像，进行相应调整。
      2. 在第二个预处理的灌流腔室中调节聚合反应，以启动微管组装（图1C），并在488 nm波长下进行观察，进行相应调整。

6. 蛋白质反应混合液的制备

1. 制备荧光标记微管蛋白的储备液。
   1. 通过分光光度法在 Abs 处测定自制未标记微管蛋白的浓度₂₈₀，如下所示：
      1. 使用不含GTP的1xBRB80缓冲液作为空白对照进行分光光度测定。
      2. 使用测定的消光系数 115,000 M⁻¹cm⁻¹ 计算微管蛋白的浓度^‐1 厘米^‐1 以及以下公式：
         
   2. 将市售的冻干赖氨酸标记488-微管蛋白用20 µL不含GTP的1x BRB80缓冲液重悬至10 µM（1 mg/mL；100%标记）。
   3. 在冰上解冻7.2 µL的100 µM未标记回收微管蛋白样品。
      注意： 回收的微管蛋白对于体外微管成功组装至关重要，因为它能够清除在冷冻蛋白储存液中形成的不具备聚合能力的二聚体。
   4. 将3 µL的10 µM 488标记微管蛋白与7.2 µL的100 µM未标记微管蛋白混合，使用前不超过15分钟。
2. 制备荧光标记肌动蛋白的储备液。
   1. 对于自制蛋白质，测定肌动蛋白的浓度和标记百分比 通过 分光光度法 AbsAbs₂₉₀ 和吸收度₆₅₀，如下所示：
      1. 用G缓冲液调零分光光度计。
      2. 使用测定的消光系数 25,974 M⁻¹cm⁻¹ 计算未标记肌动蛋白的浓度^‐1 cm^‐1 以及以下公式：
         
      3. 使用未标记肌动蛋白的消光系数、0.03 的荧光校正因子以及以下公式，计算赖氨酸标记 Alexa-647-肌动蛋白的浓度：
         
      4. 使用已确定的 Alexa-647 摩尔消光系数（ε）239,000 M⁻¹cm⁻¹ 计算 Alexa-647-肌动蛋白的标记率百分比^‐1 厘米^‐1，如下所示：
         
   2. 解冻一份2 µL的3 µM完全标记生物素化肌动蛋白（在赖氨酸残基上标记）。加入18 µL G缓冲液，稀释10倍。
   3. 将3 µL稀释的生物素化肌动蛋白与适量的未标记及标记肌动蛋白（见上文）混合，使最终混合物中肌动蛋白总浓度为12.5 µM，荧光标记比例为10%–30%。
      注意： 超过30%的荧光标记肌动蛋白单体（终浓度）可能影响成像分辨率，导致肌动蛋白丝难以与背景区分。
3. 制备反应混合液（图1C).
   1. 在成像前不超过15分钟，将2 µL的12.5 µM肌动蛋白混合液储备液（6.2.3）与微管蛋白储备液混合液（6.1.4）混合，配制细胞骨架混合液（A管）。使用前置于冰上保存。
   2. 通过混合所有其他实验组分和蛋白质来制备蛋白质反应混合液（B管），包括2×TIRF缓冲液、抗漂白剂、核苷酸、缓冲液以及辅助蛋白。示例如下所示 图1C.
      注意： 最终稀释得到的TIRF缓冲液为1x浓度，其中含有ATP、GTP，且离子强度处于估计的生理范围内。
4. 将A管和B管分别在37 °C孵育30-60秒。为启动反应，将B管中的内容物混合后加入A管中（如下）。

7. 观察肌动蛋白和微管动态

1. 条件灌注小室 （图1B；上述步骤4）.
2. 通过将 B 管（反应混合液）中的内容物加入 A 管（细胞骨架混合液）中，同时启动微丝与微管的组装图1C).
3. 加入50 µL反应液，其中含有1x TIRF缓冲液、15 µM游离微管蛋白、1 mM GTP、0.5 µM肌动蛋白单体以及适量的缓冲液对照。
4. 使用显微镜软件记录延时录像，每5秒采集一次，持续15-20分钟。
   注意： 肌动蛋白和微管动力学的启动发生在2-5分钟内（图2延迟时间较长表明反应混合物的温度控制或蛋白质浓度存在问题。
5. 孵育新的灌流小室（第4步）并用感兴趣的调节蛋白（例如 Tau）替换缓冲液体积，同时设置缓冲液对照（图1C）。按照上述第7步所述进行采集，以评估调控蛋白在新生的微丝-微管功能中的作用。

结果

图1. 实验示意图：从流动室组装到图像采集。 (A) 成像室组装。从上到下：IBIDI成像室沿灌注槽（由箭头标示）用胶带固定；第二层（白色）胶带衬底（图中保留以帮助用户更好定位）被移除，并在灌注室边缘（箭头处）涂抹环氧树脂。注意：为了更清晰地指示环氧树脂的涂抹位置，本图中保留了白色衬底。将清洗并包被好的盖玻片粘附到成像室上，包被面朝向灌注槽内部。(B) 流程图，说明用于构建生物素-链霉亲和素连接的成像室预处理步骤。(C) 用于获取动态微管和肌动蛋白丝TIRF录像的反应示例。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% BSA（w/v）	Fisher Scientific	BP1600-100	为此目的（封闭TIRF腔室），将BSA溶于ddH2O中，并通过0.22 μm滤膜过滤。 µm 滤膜
1× BRB80	自制		80 mM PIPES，1 mM MgCl2，1 mM EGTA，用KOH调至pH 6.8
80 mM PIPES，1 mM MgCl2，1 mM EGTA，用KOH调至pH 6.8	Sigma Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市	G2133-50KU	与过氧化氢酶联合分装，于 -80 oC 保存备用
100 µM 微管蛋白	Cytoskeleton 公司，丹佛，科罗拉多州	T240	自制微管蛋白在使用前应进行循环回收，以去除无法聚合的微管蛋白（Hyman et al. (1992)29；Li and Moore (2020)30）。 commercially available tubulins 常因浓度过低而不适合回收，但若按照生产商说明重新悬浮，则功能良好’s 说明并经超速离心预清除（278,000 × g) 使用前，60 分钟。
100 mM ATP	Gold Biotechnology Inc，密苏里州奥利维特	A-08	用ddH2O（pH 7.5）重悬并过滤除菌。
100 mM GTP	Fisher Scientific	AC226250010	重悬于 1× BRB80（pH 6.8）并过滤除菌。
120-150 mW 固体激光器	徕卡显微系统	11889151; 11889148
2 mg/mL 过氧化氢酶	Sigma Aldrich 公司，密苏里州圣路易斯市	C40-100	与葡萄糖氧化酶结合后，分装并储存于 -80 oC 直至使用
2× TIRF 缓冲液	自制		2× BRB80，100 mM KCl，20 mM DTT，80 mM 葡萄糖，0.5% (v/v) 甲基纤维素（4,000 cp）；注意：1 µ0.1 M GTP 溶液 L 和 1 µ为避免反复冻融，将0.1 M ATP单独加入TIRF反应体系中。
24 × 60 毫米，#1.5 盖玻片	Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州	22-266882	盖玻片在使用前必须彻底清洗（Smith et al. (2014)22）
37 oC 恒温金属浴
37 oC 水浴
5 mg/mL 链霉亲和素（600倍浓缩液）	Avantor，宾夕法尼亚州费城	RLS000-01	重悬于 Tris-HCl（pH 8.8）中；将等分试样稀释至 1× 在使用当天，置于HEK缓冲液中
5分钟环氧树脂与固化剂	Loctite，美国康涅狄格州罗基希尔	1365736	树脂与固化剂混合后可能需要长达30分钟才能固化。
50% 生物素标记的 GpCpp 微管成核种子	Cytoskeleton公司；自制	T333P	（可选）GppCpp 或紫杉醇（Taxol）稳定的微管种子可更高效地介导微管聚合。紫杉醇与 GppCpp 通过不同的机制稳定微管，这可能影响微管晶格结构以及某些调控蛋白与微管稳定区域的结合能力。Hyman 等（1992）的研究中概述了一种制备多种类型微管种子的方法。
70°C 培养箱
肌动蛋白混合物储备液	自制；本方案		12.5 µM肌动蛋白混合物，包含标记（荧光和生物素化）与未标记的肌动蛋白，适用于最多六个反应。2 µL 的库存溶液用于最终的 TIRF 反应。每个反应中所用肌动蛋白的最终浓度为 0.5 µM（10% Alexa-647；0.09% 生物素标记）
适当的缓冲液对照	自制		所有待评估蛋白质缓冲液的混合
生物素-PEG-硅烷（分子量 3,400）	莱桑生物公司	生物素-PEG-SIL-3400	分装为2-5 mg等份，充入氮气，用Parafilm封口膜密封，置于-20 °C含干燥剂的条件下保存至使用
生物素标记的肌动蛋白	Cytoskeleton公司；自制	AB07	生物素化肌动蛋白通过标记赖氨酸残基制备，因此假定其标记率至少为100%，但不同批次或制备之间可能存在差异。生物素化肌动蛋白的最佳浓度需根据具体用途或实验设计通过实验确定。较高浓度可实现更高效的追踪，但可能阻碍聚合或与调控蛋白的相互作用。本实验中，最终TIRF反应体系含有少量（0.09%或900 pM）生物素化肌动蛋白。
洗洁精	Dawn，宝洁公司，俄亥俄州辛辛那提		出于未知原因，蓝色版本清洗盖玻片的效率高于其他可用颜色的版本。
干冰
荧光标记的肌动蛋白	Cytoskeleton 公司；自制	AR05	自制荧光标记肌动蛋白保存于含50%甘油的G缓冲液中，置于-20 °C（Spudich et al. (1971) 47；Liu et al. (2022)48）。荧光标记肌动蛋白经G缓冲液透析后，通过超速离心在278,000 ×g条件下离心60分钟进行预清除。 × 使用前称重。
荧光标记的微管蛋白	Cytoskeleton公司	TL488M，TLA590M，TL670M	重悬于20 µL 1× BRB80（10 µM 终浓度）并通过超速离心预清除（278,000 × g) 使用前，室温孵育60分钟。
G缓冲液	自制		3 mM Tris-HCl (pH 8.0)，0.2 mM CaCl2，0.5 mM DTT，0.2 mM ATP
HEK缓冲液	自制		20 mM HEPES (pH 7.5)，1 mM EDTA (pH 8.0)，50 mM KCl
冰
冰桶
成像室	IBIDI，美国威斯康星州菲奇堡	80666	订购无底部的腔室，以使用不同的盖玻片涂层
iXon Life 897 EMCCD 相机	Andor，北爱尔兰贝尔法斯特	8114137
LASX 高级显微镜软件	徕卡显微系统	8114137
甲基纤维素（4,000 cp）	Sigma Aldrich 公司	M0512
配备TIRF模块的显微镜基座	徕卡显微系统公司，德国韦茨拉尔	11889146
mPEG-硅烷（分子量 2,000）