利用TIRF显微镜观察肌动蛋白与微管耦联动力学

摘要

来源：Henty-Ridilla, J.L., 可视化肌动蛋白与微管耦合动力学 体外 通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术。 视觉实验杂志. (2022)

本视频介绍了TIRF技术，这是一种基于全内反射显微镜的方法，用于观察肌动蛋白和微管聚合的动态过程。该方法能够实现对肌动蛋白与微管偶联动态的高分辨率实时成像，对于理解细胞间相互作用至关重要。

方案

1. 清洗盖玻片

注意：按照 Smith et al., 2013 的方法清洗（24 mm x 60 mm，#1.5）盖玻片。

1. 将盖玻片按顺序排列在塑料载片邮寄容器中。
2. 依次将盖玻片浸入以下溶液中，并分别超声处理30–60分钟，每更换一种溶液之间用ddH₂O冲洗10次：含一滴洗洁精的ddH₂O；0.1 M KOH。将盖玻片保存在100%乙醇中，可存放长达6个月。
   注意：切勿用手套外的手指接触玻璃表面，应使用镊子操作。

2. 使用 mPEG- 和生物素-PEG-硅烷包被已清洗的（24 mm x 60 mm，#1.5）盖玻片

注意：本方案专门使用生物素-链霉亲和素系统将肌动蛋白和微管定位在TIRF成像平面内。也可使用其他包被方法和系统（如抗体、聚-L-赖氨酸、NEM肌球蛋白等）。

1. 解冻 PEG-硅烷和生物素-PEG-硅烷粉末的分装样品。
2. 使用前，将 PEG 粉末溶解于 80% 乙醇（pH 2.0）中，配制成终浓度为 10 mg/....

结果

图1. 实验示意图：从流动室组装到图像采集。 (A) 成像室组装。从上到下：IBIDI成像室沿灌注槽（由箭头标示）用胶带固定；第二层（白色）胶带衬底（图中保留以帮助用户更好定位）被移除，并在灌注室边缘（箭头处）涂抹环氧树脂。注意：为了更清晰地指示环氧树脂的涂抹位置，本图中保留了白色衬底。将清洗并包被好的盖玻片粘附到成像室上，包被面朝向灌注槽内部。(B) 流程图，说明用于构建生物素-链霉亲和素连接的成像室预处理步骤。(C) 用于获取动态微管和肌动蛋白丝TIRF录像的反应示例。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% BSA（w/v）	Fisher Scientific	BP1600-100	为此目的（封闭TIRF腔室），将BSA溶于ddH2O中，并通过0.22 μm滤膜过滤。 µm 滤膜
1× BRB80	自制		80 mM PIPES，1 mM MgCl2，1 mM EGTA，用KOH调至pH 6.8
80 mM PIPES，1 mM MgCl2，1 mM EGTA，用KOH调至pH 6.8	Sigma Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市	G2133-50KU	与过氧化氢酶联合分装，于 -80 oC 保存备用
100 µM 微管蛋白	Cytoskeleton 公司，丹佛，科罗拉多州	T240	自制微管蛋白在使用前应进行循环回收，以去除无法聚合的微管蛋白（Hyman et al. (1992)29；Li and Moore (2020)30）。 commercially available tubulins 常因浓度过低而不适合回收，但若按照生产商说明重新悬浮，则功能良好’s 说明并经超速离心预清除（278,000 × g) 使用前，60 分钟。
100 mM ATP	Gold Biotechnology Inc，密苏里州奥利维特	A-08	用ddH2O（pH 7.5）重悬并过滤除菌。
100 mM GTP	Fisher Scientific	AC226250010	重悬于 1× BRB80（pH 6.8）并过滤除菌。
120-150 mW 固体激光器	徕卡显微系统	11889151; 11889148
2 mg/mL 过氧化氢酶	Sigma Aldrich 公司，密苏里州圣路易斯市	C40-100	与葡萄糖氧化酶结合后，分装并储存于 -80 oC 直至使用
2× TIRF 缓冲液	自制		2× BRB80，100 mM KCl，20 mM DTT，80 mM 葡萄糖，0.5% (v/v) 甲基纤维素（4,000 cp）；注意：1 µ0.1 M GTP 溶液 L 和 1 µ为避免反复冻融，将0.1 M ATP单独加入TIRF反应体系中。
24 × 60 毫米，#1.5 盖玻片	Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州	22-266882	盖玻片在使用前必须彻底清洗（Smith et al. (2014)22）
37 oC 恒温金属浴
37 oC 水浴
5 mg/mL 链霉亲和素（600倍浓缩液）	Avantor，宾夕法尼亚州费城	RLS000-01	重悬于 Tris-HCl（pH 8.8）中；将等分试样稀释至 1× 在使用当天，置于HEK缓冲液中
5分钟环氧树脂与固化剂	Loctite，美国康涅狄格州罗基希尔	1365736	树脂与固化剂混合后可能需要长达30分钟才能固化。
50% 生物素标记的 GpCpp 微管成核种子	Cytoskeleton公司；自制	T333P	（可选）GppCpp 或紫杉醇（Taxol）稳定的微管种子可更高效地介导微管聚合。紫杉醇与 GppCpp 通过不同的机制稳定微管，这可能影响微管晶格结构以及某些调控蛋白与微管稳定区域的结合能力。Hyman 等（1992）的研究中概述了一种制备多种类型微管种子的方法。
70°C 培养箱
肌动蛋白混合物储备液	自制；本方案		12.5 µM肌动蛋白混合物，包含标记（荧光和生物素化）与未标记的肌动蛋白，适用于最多六个反应。2 µL 的库存溶液用于最终的 TIRF 反应。每个反应中所用肌动蛋白的最终浓度为 0.5 µM（10% Alexa-647；0.09% 生物素标记）
适当的缓冲液对照	自制		所有待评估蛋白质缓冲液的混合
生物素-PEG-硅烷（分子量 3,400）	莱桑生物公司	生物素-PEG-SIL-3400	分装为2-5 mg等份，充入氮气，用Parafilm封口膜密封，置于-20 °C含干燥剂的条件下保存至使用
生物素标记的肌动蛋白	Cytoskeleton公司；自制	AB07	生物素化肌动蛋白通过标记赖氨酸残基制备，因此假定其标记率至少为100%，但不同批次或制备之间可能存在差异。生物素化肌动蛋白的最佳浓度需根据具体用途或实验设计通过实验确定。较高浓度可实现更高效的追踪，但可能阻碍聚合或与调控蛋白的相互作用。本实验中，最终TIRF反应体系含有少量（0.09%或900 pM）生物素化肌动蛋白。
洗洁精	Dawn，宝洁公司，俄亥俄州辛辛那提		出于未知原因，蓝色版本清洗盖玻片的效率高于其他可用颜色的版本。
干冰
荧光标记的肌动蛋白	Cytoskeleton 公司；自制	AR05	自制荧光标记肌动蛋白保存于含50%甘油的G缓冲液中，置于-20 °C（Spudich et al. (1971) 47；Liu et al. (2022)48）。荧光标记肌动蛋白经G缓冲液透析后，通过超速离心在278,000 ×g条件下离心60分钟进行预清除。 × 使用前称重。
荧光标记的微管蛋白	Cytoskeleton公司	TL488M，TLA590M，TL670M	重悬于20 µL 1× BRB80（10 µM 终浓度）并通过超速离心预清除（278,000 × g) 使用前，室温孵育60分钟。
G缓冲液	自制		3 mM Tris-HCl (pH 8.0)，0.2 mM CaCl2，0.5 mM DTT，0.2 mM ATP
HEK缓冲液	自制		20 mM HEPES (pH 7.5)，1 mM EDTA (pH 8.0)，50 mM KCl
冰
冰桶
成像室	IBIDI，美国威斯康星州菲奇堡	80666	订购无底部的腔室，以使用不同的盖玻片涂层
iXon Life 897 EMCCD 相机	Andor，北爱尔兰贝尔法斯特	8114137
LASX 高级显微镜软件	徕卡显微系统	8114137
甲基纤维素（4,000 cp）	Sigma Aldrich 公司	M0512
配备TIRF模块的显微镜基座	徕卡显微系统公司，德国韦茨拉尔	11889146
mPEG-硅烷（分子量 2,000）