使用晶格光片显微镜可视化活细胞中受体-配体相互作用

摘要

来源：Rosenberg, J.，等。利用晶格光片显微镜四维可视化T细胞受体表面动力学。J. Vis. Exp. (2020)。

在本视频中，我们介绍了一种晶格光片显微镜技术，用于可视化活体T细胞与抗原呈递细胞之间的相互作用。该方法通过将超薄的晶格光片聚焦于正在相互作用的细胞对上，获取一系列二维图像，并将这些图像进行整合，从而获得高分辨率的四维图像，揭示细胞间相互作用的空间-时间动态过程。

方案

1. 进行 LLSM 日常校准

注意：（重要）本对准方案基于所使用的 LLSM 仪器（参见材料表）。每台 LLSM 可能各不相同，需要采用不同的对准策略，尤其是自行搭建的系统。请执行相应的常规对准操作，然后继续进行第 2 节。

1. 向LLSM浴槽（约10 mL体积）中加入10 mL水和30 µL荧光素（1 mg/mL储备液），按“图像”（主页）按钮将物镜移至成像位置，观察单个贝塞尔激光束的图案。使用导引标记和预设的兴趣区域（ROI）对激光束进行对准，使光束呈现为在各个方向上均匀且细窄的图案。
   1. 光束在寻像相机中也应显示为聚焦状态。使用两个镜片倾斜调节器、顶部微米调节器、聚焦装置以及发射物镜环进行调整。正确对准的光束参见图1 A和B。
2. 用至少200 mL水清洗浴槽和物镜，彻底去除荧光素。
3. 在成像介质中对标准荧光微球进行成像（通过将微球用聚-L-赖氨酸固定在5 mm盖玻片上制备，参见材料表；该样品可预先制备并重复使用），以获取成像介质中的物理点扩散函数（PSF）。
   注意：为便于后续处理，视野中只能存在一个微球，因此应尽量寻找孤立的微球，或易于裁剪以获得单一微球的视野....

结果

图 1： LLSM 对准。 （A）LLSM 成像实验所需的光束图样。（B）光束对准过程的截图；左侧为聚焦窗口，显示变窄且聚焦的光束；右上方为图表，显示光束位于窗口中心；右下方为寻像相机图像，也应呈现细而聚焦的光束。（C）通过物镜扫描获得的微珠最大强度投影（MIPs）。（D）通过 z 轴振镜扫描获得的微珠最大强度投影（MIPs）。（E）通过 z 轴振镜+物镜扫描获得的微珠最大强度投影（MIPs）。（F）通过样品扫描获得的微珠最大强度投影（MIPs）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mm 圆形盖玻片	World Precision Instruments	502040	用于成像
Alexa Fluor 488 抗小鼠 TCR β 链抗体	BioLegend	109215	用于成像
荧光素钠盐	Sigma-Aldrich	F6377	用于显微镜校准
FluoSpheres 羧基修饰微球	Thermo Fisher Scientific	F8810	用于显微镜校准
Imaris	Bitplane	N/A	追踪软件；其他可选追踪软件包括 Amira 或 Trackmate (Fiji)。
晶格光片显微镜	3i	N/A	所使用的显微镜
Leibovitz's L-15 培养基，无酚红	Thermo Fisher Scientific	21083027	用于成像
Slidebook	3i	N/A	LLSM 成像软件
Poly-L-Lysine 	Phenix Research Products 	P8920-100ML 	用于成像