使用晶格光片显微镜可视化活细胞中受体-配体相互作用

摘要

来源：Rosenberg, J.，等。利用晶格光片显微镜四维可视化T细胞受体表面动力学。J. Vis. Exp. (2020)。

在本视频中，我们介绍了一种晶格光片显微镜技术，用于可视化活体T细胞与抗原呈递细胞之间的相互作用。该方法通过将超薄的晶格光片聚焦于正在相互作用的细胞对上，获取一系列二维图像，并将这些图像进行整合，从而获得高分辨率的四维图像，揭示细胞间相互作用的空间-时间动态过程。

方案

1. 进行 LLSM 日常校准

注意：（重要）本对准方案基于所使用的 LLSM 仪器（参见材料表）。每台 LLSM 可能各不相同，需要采用不同的对准策略，尤其是自行搭建的系统。请执行相应的常规对准操作，然后继续进行第 2 节。

1. 向LLSM浴槽（约10 mL体积）中加入10 mL水和30 µL荧光素（1 mg/mL储备液），按“图像”（主页）按钮将物镜移至成像位置，观察单个贝塞尔激光束的图案。使用导引标记和预设的兴趣区域（ROI）对激光束进行对准，使光束呈现为在各个方向上均匀且细窄的图案。
   1. 光束在寻像相机中也应显示为聚焦状态。使用两个镜片倾斜调节器、顶部微米调节器、聚焦装置以及发射物镜环进行调整。正确对准的光束参见图1 A和B。
2. 用至少200 mL水清洗浴槽和物镜，彻底去除荧光素。
3. 在成像介质中对标准荧光微球进行成像（通过将微球用聚-L-赖氨酸固定在5 mm盖玻片上制备，参见材料表；该样品可预先制备并重复使用），以获取成像介质中的物理点扩散函数（PSF）。
   注意：为便于后续处理，视野中只能存在一个微球，因此应尽量寻找孤立的微球，或易于裁剪以获得单一微球的视野。
   1. 在“X振镜范围”框中将dither设置为3以开启该功能。点击实时按钮查看当前视野。沿Z方向移动以找到盖玻片和微球。沿Z方向移动定位微球中心后，点击停止暂停激光。勾选3D，点击居中，然后点击执行，开始采集数据。
   2. 手动调节倾斜镜、物镜环和聚焦微米调节器，使灰度值达到最高，然后根据需要进一步调整，以获得适用于物镜扫描、Z振镜、Z+物镜（totPSF）和样品扫描（samplePSF）采集模式的合适图案。正确的最大强度投影（MIPs）参见图1 C-F。
      注意：不同的采集模式（物镜扫描、Z振镜、Z+物镜和样品扫描）会改变光片穿过样品的方式。所有扫描模式均需用于对准。
   3. 样品扫描模式显示了实验过程中数据的采集方式。在样品扫描模式下点击执行以采集用于去倾斜和去卷积的样品PSF。切换激光至三色模式（488、560、647），再次点击执行。
      注意：由于LLSM图像以一定角度（57.2°）采集，“样品扫描”模式下获取的图像也以该角度采集，因此呈“倾斜”状态。去倾斜是指校正该角度并将图像“重新对齐”为真实的Z堆栈图像。这些数据必须在成像介质中采集，并覆盖实验中将要使用的全部通道。若未正确采集，数据将无法正确去倾斜。同样，请确保介质已预热至37 °C（或实验所需的其他温度）。

2. 使用 LLSM 建立细胞实验

1. 将100,000个抗原呈递细胞（APCs）（50 µL）加入直径为5 mm的圆形盖玻片上，静置10分钟使其沉降。
2. 在样品台表面涂抹润滑脂，然后将盖玻片细胞面向上放置于样品台上。在将盖玻片放入灌流槽前，向其背面滴加一滴成像培养基以避免产生气泡。将样品台旋紧至压电位移器上，然后点击成像（归位）。
3. 寻找一个可用于成像的APC，以确认LLSM系统及成像软件（参见材料表）正常工作。
   注意：我们采用0.4 µm的步进尺寸，进行60层Z轴扫描，双色成像曝光时间为10 ms，dither参数设为3，由此获得每帧约1.54秒的三维图像，XY方向分辨率为~200 nm，Z方向分辨率为400 nm。这些参数可能需要根据细胞大小、所需的Z轴分辨率以及所用荧光标记技术的信号强度进行调整。激光功率的设置也需依据所使用的荧光标记方法进行相应调整。
   1. 点击实时预览以查看当前图像，沿Z轴方向移动以找到盖玻片和细胞。
   2. 通过Z轴方向移动定位APC的中心，然后点击停止以暂停激光扫描。勾选3D选项并输入所需参数，点击居中，然后点击执行，开始采集数据。
4. 将载物台降至装载位置，直接在盖玻片上方逐滴加入50 µL含T细胞的成像培养基（100,000个细胞）。建议让液滴在移液器吸头末端形成后，再将吸头轻触灌流槽中的液体表面。随后点击“成像（返回）”将载物台升回成像位置。
5. 开始成像。请务必设置所需的Z轴层数和延时成像时长。例如，设置Z轴步数为60层，步进尺寸为0.4 µm，并输入500个时间帧。（通常）在达到500帧之前停止记录，以避免光漂白。使用实时预览模式寻找细胞配对，当准备就绪且参数设置完成后，点击执行以开始数据采集。参见图2以了解示例。

结果

图 1： LLSM 对准。 （A）LLSM 成像实验所需的光束图样。（B）光束对准过程的截图；左侧为聚焦窗口，显示变窄且聚焦的光束；右上方为图表，显示光束位于窗口中心；右下方为寻像相机图像，也应呈现细而聚焦的光束。（C）通过物镜扫描获得的微珠最大强度投影（MIPs）。（D）通过 z 轴振镜扫描获得的微珠最大强度投影（MIPs）。（E）通过 z 轴振镜+物镜扫描获得的微珠最大强度投影（MIPs）。（F）通过样品扫描获得的微珠最大强度投影（MIPs）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mm 圆形盖玻片	World Precision Instruments	502040	用于成像
Alexa Fluor 488 抗小鼠 TCR β 链抗体	BioLegend	109215	用于成像
荧光素钠盐	Sigma-Aldrich	F6377	用于显微镜校准
FluoSpheres 羧基修饰微球	Thermo Fisher Scientific	F8810	用于显微镜校准
Imaris	Bitplane	N/A	追踪软件；其他可选追踪软件包括 Amira 或 Trackmate (Fiji)。
晶格光片显微镜	3i	N/A	所使用的显微镜
Leibovitz's L-15 培养基，无酚红	Thermo Fisher Scientific	21083027	用于成像
Slidebook	3i	N/A	LLSM 成像软件
Poly-L-Lysine 	Phenix Research Products 	P8920-100ML 	用于成像