暗视野显微镜观察纳米棒在细胞膜上的扩散动力学

摘要

来源：Ge, F., 等. 利用单纳米颗粒暗场显微镜观察金纳米棒在细胞膜上的扩散动力学. J. Vis. Exp. (2021)。

在本视频中，我们介绍了将暗场显微镜（DFM）技术与单颗粒追踪（SPT）分析相结合，用于监测等离激元金纳米棒与特定细胞系细胞膜之间相互作用的方法。结合使用DFM与SPT分析，能够以高时空分辨率可视化纳米棒在细胞膜上的运动过程。

方案

1. 显微镜载玻片制备

注意：SPT 实验中使用第3至第10代且活性较高的 U87 MG 细胞。

1. 将已用Piranha溶液清洗过的22 mm × 22 mm盖玻片浸入乙醇（99.9%）中进行灭菌。
2. 用镊子将盖玻片从乙醇溶液（步骤1.1）中取出，通过火焰灼烧去除残留乙醇以完成灭菌。待乙醇完全燃烧后，将盖玻片放入盛有2 mL细胞培养基（无酚红）的塑料细胞培养皿（35 × 10 mm）中。
3. 在盖玻片上加入50 µL细胞悬液，并轻轻前后、左右移动培养皿，使细胞均匀分布。将其置于湿润环境中。
4. 当盖玻片上的U87 MG细胞达到20%–40%融合度（约12小时）时，向培养皿中加入20 μL CTAB-AuNRs（以十六烷基三甲基溴化铵分子作为保护剂合成的金纳米棒，138 pM），并使其分散。在湿润环境中孵育5分钟。
5. 从步骤1.4的培养皿中取出100 μL培养基（无酚红），加入经Piranha溶液预清洗的带槽玻璃载玻片的槽内（图1）。
6. 将盖玻片从培养皿中取出，倒置在显微镜玻璃载玻片的槽上方（图1），用指甲油密封，待其干燥后，置于显微镜载物台上进行单粒子追踪（SPT）实验。

2. 使用暗场显微镜进行单颗粒追踪实验（图1）。

1. 在油浸暗场聚光镜（数值孔径 (NA) 1.43–1.20）上滴加一滴油，并转动旋钮使聚光镜与玻片接触。
2. 在盖玻片顶部滴加一滴油，转动调焦旋钮，使60倍油镜物镜（NA 0.7–1.25）接触油滴。
3. 打开光源，轻微转动调焦旋钮以聚焦成像平面。
   注意： 视野中背景为黑色，细胞呈亮态，CTAB-AuNRs（长径比约2:1，图2）呈现为微小的有色（红色、黄色或绿色）散射光点。
4. 通过彩色CMOS相机采集样品的散射光信号。在软件中点击“相机图标”以录制并导出TIFF格式图像进行保存。

3. 数据采集

1. 提取单个长期轨迹
   1. 按照 图3 所示操作，将时间序列的暗场图像从“RGB颜色”模式转换为“8位”模式。在Image J中点击 图像 | 类型 | 8位。为调整对比度，点击 图像 | 调整 | 亮度 | 对比度。
   2. 选择目标粒子，并通过框选背景后按“Ctrl+X”删除，以裁剪时间序列中的背景。
   3. 点击“插件 | 粒子追踪经典版 | 粒子追踪器”打开粒子检测与粒子连接窗口。
   4. 将半径设为6，截断值设为0，百分位数设为0.01%。
      注意： 为检测粒子，可在预览辅助下调整上述三个参数。确保半径略大于目标粒子，且小于粒子间的最小间距。百分位数是指作为候选粒子的强度分布下限。
   5. 将连接范围设为5，位移设为10。
      注意： 为在连续相邻帧之间连接粒子，需调整上述两个参数。位移表示粒子在两帧之间可移动的最大像素数，连接范围表示在确定最佳匹配时所考虑的连续帧数。
   6. 点击“确定”以打开ParticleTracker结果窗口查看结果。
   7. 点击“可视化所有轨迹”以检查生成的轨迹。
   8. 若软件生成的轨迹与AuNR的实际运动轨迹不符，可点击顶部的“重新连接粒子”菜单，使用不同的连接范围和百分位参数重新连接已检测的粒子。
   9. 若软件生成的轨迹与AuNR的运动轨迹一致，点击“保存完整报告”以保存结果。
      注意：使用Image J提取单个长期轨迹的示例如 图4 所示。

结果

图1：暗场显微镜光路示意图、显微载玻片制备方法，以及用于计算金纳米棒（AuNRs）极角（θ）的双通道差分法。 图中比例尺为 2 μm。

图 2：CTAB-AuNRs 的表征。（A）CTAB@AuNRs 的透射电子显微镜（TEM）图像。（B）CTAB@AuNRs 的局域...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CTAB 包被的金纳米棒（CTAB-AuNRs）	Nanoseedz	NR-40-650	85 nm*40 nm
彩色 CMOS 相机	Olympus	DP74	日本
盖玻片	Citoglas	z10212222C	22*22 mm
暗场显微镜	Nikon	80i	正置显微镜
胎牛血清（FBS）	Gibco	10099141
Fiji	美国国立卫生研究院	2.0.0-rc-69/1.52 p	ImageJ 的一个发行版本
带槽玻璃载片	Sail 品牌	7103	单凹型
Image J	Image J	1.52 j
MATLAB	MathWorks	R2019b
MATLAB 代码			https://github.com/fenggeqd/ JOVE-2020
塑料细胞培养皿	Falcon	353002
塑料细胞培养皿	Falcon	353001	35*10 mm
U87 MG 细胞	美国模式培养物集存库	ATCC HTB-14	一种人源原发性胶质母细胞瘤细胞系
最低必需培养基（MEM） 	Gibco 	51200038	无酚红
青霉素-链霉素 	Gibco 	15140122