无需标记的微管动力学干涉反射显微成像

摘要

来源：Mahamdeh, M.，等。无标记、高速微管成像的干涉反射显微镜实现方法。J. Vis. Exp. (2019)。

在本视频中，我们介绍了干涉反射显微镜（IRM）技术，用于在适当缓冲液存在下，对盖玻片表面生长的微管进行可视化观察。当入射光照射时，盖玻片-缓冲液界面和缓冲液-微管界面均会反射光线，这些反射光相互叠加形成干涉图样，从而能够在明亮背景上以高对比度图像清晰显示微管结构。

方案

1. 显微镜改装与物镜

1. 使用合适的滤光片组，将50/50分光镜插入荧光显微镜的滤光轮中（图1）。操作50/50分光镜时需小心，因其表面通常带有抗反射涂层。
   注意： 本实验中，我们将50/50分光镜安装在显微镜的一个空滤光片组中，并将其置于原本放置二向色镜的位置。
2. 使用高倍率/高数值孔径（NA）的油镜物镜。
   注意： 在本实验方案中，我们使用了100倍、数值孔径1.3的物镜。

2. 制备反应室以使微管黏附于表面

1. 清洗显微镜载玻片以及22 mm × 22 mm盖玻片（用于正置显微镜）或22 mm × 22 mm和18 mm × 18 mm盖玻片（用于倒置显微镜）。根据需要对表面进行修饰。例如，使用碱性洗涤剂（见材料表）清洗盖玻片，中间及之后用100%乙醇和蒸馏水依次洗涤。
2. 使用剃刀刀片和另一张显微镜载玻片作为边缘，切割出3 mm宽的塑料石蜡膜条（见材料表）。
3. 将两条3 mm宽的塑料石蜡膜条平行放置在洁净的22 mm × 22 mm盖玻片上，间距为3 mm。然后放置一张18 mm × 18 mm盖玻片以....

结果

图1. 干涉反射显微镜（IRM）示意图。（A） 来自光源的落射照明光束穿过孔径光阑后到达50/50分光镜。孔径光阑决定了光束宽度，从而设定了照明的数值孔径（NA）。50/50分光镜将部分光线反射至物镜，用于照射样品。从样品反射的光线被收集后，经管镜投射到相机芯片上，在此处发生干涉并形成图像。图像对比度源于玻璃/水界面反射光（I1）与水/微管界面反射光（I2）之间的干涉效应。根据微管与表面之间的距离（h），I1与I2之间的光程差将导致相长干涉（明亮信号）、相消干涉（暗信号），或介于两者之间的任意状态。例如，若使用波长为600 nm的光进行成像，当微管高度变化约100 nm时，图像对比度将在暗与亮之间切换。星号表示共轭平面。（B） 50/50分光镜安装示例。打开一个合适的滤光片盒，将该分光镜插入通常.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微镜	Nikon	Ti-Eclipse	用于进行实验的倒置显微镜
50/50 分束器	Chroma	21000	购买时请确保选择适合显微镜所用滤光块尺寸的分束器
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris 物镜	Nikon	MRH02902	成像物镜。该物镜具有可调数值孔径（NA）的虹膜，实验中将其打开至 NA 1.3
Mucasol 通用去污剂	Sigma-Aldrich	Z637181-2L	用于清洁盖玻片和载玻片
塑料石蜡膜（商品名 Parafilm M）	Sigma-Aldrich	P7793	用于构建流动通道
抗 TAMRA 抗体	Invitrogen	A-6397	用于将 TAMRA 标记的分子（例如微管）结合到样品表面。RRID (AB_2536196)
Poloxamer 407（商品名 Pluronic F-127）	Sigma-Aldrich		用于封闭通道表面，防止非特异性结合
40 nm 金纳米颗粒	Sigma-Aldrich	753637	用作对照样品
20 nm 金纳米颗粒	Sigma-Aldrich	753610	用作对照样品
Zyla 4.2 相机	Andor	Zyla 4.2	2048×2048 像素（6.5µm 像素尺寸），量子效率为 72%，动态范围为 16 位
Feista 跟踪软件			https://www.bcube-dresden.de/ fiesta/wiki/FIESTA
稳定化微管			实验室自制（参见文中参考文献）