干涉反射显微镜用于微管动力学的无标记可视化

Abstract

来源:Mahamdeh， M. 等人。实施干涉反射显微镜，实现微管的无标记高速成像。J. Vis. Exp.（2019 年）。

在本视频中，我们介绍了干涉反射显微镜 （IRM） 技术，该技术可在合适的缓冲液存在下可视化在盖玻片表面上生长的微管。在用入射光照射时，盖玻片-缓冲液界面和缓冲液-微管界面会反射光线，这些光结合在一起形成干涉图案，从而能够在明亮的背景下将微管可视化为高对比度图像。

Protocol

1. 显微镜改造和物镜

1. 使用适当的滤光片立方体将 50/50 镜子插入荧光显微镜的滤光片转盘中（图 1）。小心处理 50/50 镜子，因为它们经常有防反射涂层。
   注意:我们在显微镜的空滤光片立方体中使用了 50/50 镜子。50/50 镜子插入二向色镜所在的位置。
2. 使用高放大倍率/高数值孔径 （NA） 油物镜。
   注意:在该协议中，我们使用了 100x/1.3 NA 物镜。

2. 将微管粘附到表面的腔室准备

1. 清洁显微镜载玻片和 22 mm x 22 mm 盖玻片（用于正置显微镜）或 22 mm x 22 mm 和 18 mm x 18 mm 盖玻片（用于倒置显微镜）。根据需要修改表面。例如，使用碱性清洁剂（参见材料表）清洁盖玻片，然后在两者之间和之后使用 100% 乙醇和蒸馏水清洗。
2. 使用剃须刀片和另一个显微镜载玻片作为边缘切割 3 mm 宽的塑料石蜡薄膜条（参见材料表）。
3. 将两条相距 3 mm 的塑料石蜡薄膜条放在干净的 22 x 22 mm 盖玻片上。然后放置 18 mm x 18 mm 的盖玻片以形....

Results

图 1.IRM 的示意图。（A） 来自光源的落射照明在到达 50/50 反射镜之前穿过孔径光阑。孔径光阑设置光束宽度，因此照明 NA。50/50 反射镜将光线部分反射到物镜以照亮样品。收集从样品反射的光，然后投射到相机芯片（通过镜筒透镜）上，在那里它发生干涉以生成图像。图像对比度是从玻璃/水界面反射的光 （I1） 与从水/微管界面反射的光 （I2） 之间干涉的结果。根据微管/表面距离 （h），I1 和 I2 之间的光程差将导致建设性（亮信号）或破坏性（暗信号），或介于两者之间的任何值。例如，如果使用波长为 600 nm 的光进行成像，则当微管高度变化约 100 nm 时，对比度将在暗和亮之间切换。星号表示共轭平面。（B） 50/50 镜像安装示例。打开一个合适的滤光片立方体，将镜子插入二向色镜通常所在的位置。镜子按照制造商的说明进行定向。然后将立方体插入滤光片转盘中，滤光片转盘重新插入显微镜（未显示）。在安装过程中，使用了手套，镜子只靠.......

Materials