干涉反射显微镜用于微管动力学的无标记可视化

Abstract

来源:Mahamdeh， M. 等人。实施干涉反射显微镜，实现微管的无标记高速成像。J. Vis. Exp.（2019 年）。

在本视频中，我们介绍了干涉反射显微镜 （IRM） 技术，该技术可在合适的缓冲液存在下可视化在盖玻片表面上生长的微管。在用入射光照射时，盖玻片-缓冲液界面和缓冲液-微管界面会反射光线，这些光结合在一起形成干涉图案，从而能够在明亮的背景下将微管可视化为高对比度图像。

Protocol

1. 显微镜改造和物镜

1. 使用适当的滤光片立方体将 50/50 镜子插入荧光显微镜的滤光片转盘中（图 1）。小心处理 50/50 镜子，因为它们经常有防反射涂层。
   注意:我们在显微镜的空滤光片立方体中使用了 50/50 镜子。50/50 镜子插入二向色镜所在的位置。
2. 使用高放大倍率/高数值孔径 （NA） 油物镜。
   注意:在该协议中，我们使用了 100x/1.3 NA 物镜。

2. 将微管粘附到表面的腔室准备

1. 清洁显微镜载玻片和 22 mm x 22 mm 盖玻片（用于正置显微镜）或 22 mm x 22 mm 和 18 mm x 18 mm 盖玻片（用于倒置显微镜）。根据需要修改表面。例如，使用碱性清洁剂（参见材料表）清洁盖玻片，然后在两者之间和之后使用 100% 乙醇和蒸馏水清洗。
2. 使用剃须刀片和另一个显微镜载玻片作为边缘切割 3 mm 宽的塑料石蜡薄膜条（参见材料表）。
3. 将两条相距 3 mm 的塑料石蜡薄膜条放在干净的 22 x 22 mm 盖玻片上。然后放置 18 mm x 18 mm 的盖玻片以形成通道。如果使用正置显微镜，请将试纸条放在干净的显微镜载玻片上，然后将盖玻片放在顶部。
4. 将盖玻片（或载玻片）放在 100 °C 的加热块上 10-30 秒，使石蜡膜形成密封通道。
5. 使用移液管灌注流入 50 μg/mL 抗体（在 Brinkley 缓冲液 1980 （BRB80） 中）。孵育 10 分钟
   注意: 我们使用抗罗丹明抗体将罗丹明标记的微管种子结合到表面。或者，亲和素可用于结合生物素标记的微管种子或生物素化的金颗粒。为了在溶液中没有微管蛋白的情况下简单地观察微管（即非动态测定），可以使用抗微管蛋白抗体。
6. 用 BRB80 缓冲液洗涤五次。建议使用 0.22 μm 过滤器过滤溶液。
7. 在 BRB80 中流入 1% 泊洛沙姆 407（一种三嵌段共聚物），以阻止表面与非特异性结合。孵育 10 分钟。
8. 用 BRB80 缓冲液洗涤五次。
9. 样品已准备好放在显微镜上。为防止样品变干，请在通道末端添加两滴 BRB80 缓冲液，并在需要时补充。

3. 显微镜对准

1. 将样品放在显微镜载物台上。打开 epi-illumination 光源。
2. 聚焦于样品表面。由于光路内光学元件的光的背向反射，物镜上下移动时，您将观察到多个表面。找到样品表面的一个好方法是聚焦石蜡膜边缘。找到表面后，将视野设置为腔室的中心。
将
3. 视场光阑半合上并使用调节螺钉，使其在视场中居中。对齐后，重新打开隔膜。
   注意:螺钉调整只需要偶尔进行一次，可能每 3-6 个月或在故障排除时进行一次。
4. 滑入 Bertrand 镜头以查看物镜的出瞳（后焦平面）。
5. 将孔径光阑 （AD） 关闭到物镜出射光瞳边缘之外。
6. 使用调节螺钉使 AD 与出瞳居中。通过打开 AD 并将其边缘与出瞳的边缘匹配来仔细检查。
   注意:此调整只需偶尔进行。
7. 将孔径光阑设置为物镜 NA 的 2/3 左右。

4. 稳定微管或 40 nm 金颗粒成像

注意:稳定的微管和金纳米颗粒是良好的对照样品。建议对表面附着的微管或金纳米颗粒进行成像，作为评估 IRM 性能并帮助设置最佳孔径光阑开口的第一步（第 7 节）。

1. 将摄像机的曝光时间设置为 10 毫秒，并调整照明以使摄像机动态范围接近饱和。
2. 使用移液管灌注 BRB80（或 40 nm 金颗粒）中的 10 μL 鸟苷基-（α、β）-亚甲基-二膦酸盐 （GMPCCP） 或紫杉醇稳定的微管，流入新鲜样品，并通过表面成像监测结合。一旦 10-20 个微管结合在视野内，用 BRB80.
   洗涤样品 2 次 注意:使用对准良好的显微镜，微管应该是可见的，没有背景扣除。
3. 通过将延迟时间为 1 秒的延时摄影设置为 10 秒（曝光 10 毫秒时），获取 10 张图像。
4. 获取背景图像。为此，请使用载物台控制器或计算机软件沿通道长轴移动载物台，同时无延迟地采集 100 张图像（即，以接近 100 fps @ 10 ms 曝光的速度流式传输）。
   注意: 背景是 100 张图像的中位数。通过取中位数，照明剖面和其他静止特征（如光学元件上的污垢）被保留，而其他所有内容都被过滤掉。样品上不应有倾斜，因为这会导致载物台移动时轴向位置发生变化，并最终降低背景图像质量。如果无法避免倾斜，则另一种方法是在种子流动之前获取平均背景图像。
5. 要处理和分析图像，请转到步骤 6。

5. 微管动力学成像

1. 对于使用脑微管蛋白的微管动力学，将样品加热器温度设置为 37 °C。
2. 使用移液管灌注 BRB80 中的 10 μL GMPCCP 稳定的微管种子流入新鲜样品中，并通过实时对表面成像（即，在流式时）监测它们与表面的结合。一旦 10-20 颗种子与视野结合，使用 2 倍通道体积和 BRB80 洗涤样品（BRB80 应预热至 37 °C 或至少在室温下><）。 注意:使用对齐良好的显微镜，种子应该是可见的，没有背景扣除。
3. 聚合混合物中的流动（7.5 μM 未标记的微管蛋白 + 1 mM 三磷酸鸟苷 （GTP） + 1 mM 二硫苏糖醇 （DTT） 在 BRB80 缓冲液中）。为了测量微管生长，使用采集软件设置延时摄影，每 5 秒（0.2 帧/秒 （fps））采集一张图像，持续 15 分钟。
4. 为了增强对比度，请在每个时间点获取 10 张图像（而不是 1 张）并平均它们。对于微管收缩，通过将时间延迟设置为 0 和 10ms 的曝光时间，以 100 fps 的速度获取图像（根据使用的相机，感兴趣的区域较小时可能会获得更高的 fps）。
5. 按照步骤 4.4 获取背景图像。

6. 图像处理和分析

注意:为了进行分析，该协议使用斐济，但读者可以自由使用她/他认为合适的任何软件。

1. 打开保存的背景图像。
2. 使用>中位数的 Image > Stack > Z 项目计算中位数图像（即背景）。
3. 使用 File > Open 将微管动力学影片作为堆栈（与非动态微管相同）打开。
4. 使用 Process > Image 计算器从堆栈中减去背景图像。确保选中 "32bit （float） result" 选项。
5. 对于动态微管，使用线条工具沿感兴趣的微管画一条线，然后按 "t" 将其添加到感兴趣的区域管理器中。对所有感兴趣的微管重复此作。
6. 对于动态微管，请运行 Multi-Kymo 宏。宏将为 ROI 管理器中的每个微管生成一个视频和一个运动图。每个微管都将获得一个唯一的标识符。
7. 对于动态微管，运行 Kymo-Analysis 宏并按照其步骤测量微管的生长速率和收缩速率。

7. 孔径光阑尺寸

注意:使用 IRM 获取微管高对比度图像的一个重要因素是正确设置照明数值孔径 （INA）。可以通过改变物镜出瞳处入射照明光束的大小来改变 INA，该尺寸由 AD 的大小控制（AD 位于物镜出瞳（后焦平面）的共轭平面上，图 1）:

其中 DAD 是孔径光阑的直径，f_物镜是物镜的焦距，D_ep 是物镜的出瞳直径。通常，AD 完全打开以进行荧光成像，因此 INA 等于物镜的 NA。在荧光显微镜中，AD 标度并不表示其直径，因此无法计算 INA。可以借助目标校准 AD 大小。但是，这没有必要，因为 AD 大小将固定为产生最高对比度的大小。

1. 准备粘附在表面的荧光标记的稳定微管样品（步骤 4.1-4.2）
   注意:我们使用四甲基罗丹明标记的微管 （Ex: 550 nm， Em: 580 nm）。
2. 使用显微镜聚焦旋钮使微管聚焦，同时对微管进行荧光成像（如果微管未标记，则使用 IRM 或 DIC 对其进行成像）。
3. 使用相机软件将相机曝光设置为 10 毫秒。
   注意:这种曝光是任意的，100 毫秒的曝光也适用。
4. 将 AD 关闭到其最小的开口。调整照明以使相机的动态范围接近饱和或达到最大可能。
   注意:作为指导，请使用客户获取软件通常提供的查找表。
5. 获取包含 10+ 微管的视野的 10 张图像（通过每秒流式传输或拍摄图像）。
6. 按照步骤 4.4 获取背景图像。
7. 更改 AD 的大小，并对整个 AD 张开范围（从闭合到出瞳大小，图 2）重复步骤 7.5-7.6。每次更改 AD 大小时，调整照明强度以匹配步骤 7.4 的照明强度。
8. 对于获取的每个视野，使用过程>图像计算器减去相应的背景，然后从下拉菜单中选择"减去"。确保选中 "32bit （float） result" 选项。然后使用 Image > stack > Z project> average 对生成的图像进行平均。
9. 测量微管的信噪比 （SBR），定义为微管信号的平均强度（微管的强度减去背景的强度）除以背景的标准偏差（图 3）。
10. 通过计算每个开口大小的微管的平均 SBR，确定最佳 AD 大小（即最佳 INA），并将 AD 大小设置为产生最高 SBR 的大小（图 2）。可能有一系列 AD 大小可以产生可比较的对比度。

Results

图 1.IRM 的示意图。（A） 来自光源的落射照明在到达 50/50 反射镜之前穿过孔径光阑。孔径光阑设置光束宽度，因此照明 NA。50/50 反射镜将光线部分反射到物镜以照亮样品。收集从样品反射的光，然后投射到相机芯片（通过镜筒透镜）上，在那里它发生干涉以生成图像。图像对比度是从玻璃/水界面反射的光 （I1） 与从水/微管界面反射的光 （I2） 之间干涉的结果。根据微管/表面距离 （h），I1 和 I2 之间的光程差将导致建设性（亮信号）或破坏性（暗信号），或介于两者之间的任何值。例如，如果使用波长为 600 nm 的光进行成像，则当微管高度变化约 100 nm 时，对比度将在暗和亮之间切换。星号表示共轭平面。（B） 50/50 镜像安装示例。打开一个合适的滤光片立方体，将镜子插入二向色镜通常所在的位置。镜子按照制造商的说明进行定向。然后将立方体插入滤光片转盘中，滤光片转盘重新插入显微镜（未显示）。在安装过程中，使用了手套，镜子只靠...

Materials