无需标记的微管动力学干涉反射显微成像

摘要

来源：Mahamdeh, M.，等。无标记、高速微管成像的干涉反射显微镜实现方法。J. Vis. Exp. (2019)。

在本视频中，我们介绍了干涉反射显微镜（IRM）技术，用于在适当缓冲液存在下，对盖玻片表面生长的微管进行可视化观察。当入射光照射时，盖玻片-缓冲液界面和缓冲液-微管界面均会反射光线，这些反射光相互叠加形成干涉图样，从而能够在明亮背景上以高对比度图像清晰显示微管结构。

方案

1. 显微镜改装与物镜

1. 使用合适的滤光片组，将50/50分光镜插入荧光显微镜的滤光轮中（图1）。操作50/50分光镜时需小心，因其表面通常带有抗反射涂层。
   注意： 本实验中，我们将50/50分光镜安装在显微镜的一个空滤光片组中，并将其置于原本放置二向色镜的位置。
2. 使用高倍率/高数值孔径（NA）的油镜物镜。
   注意： 在本实验方案中，我们使用了100倍、数值孔径1.3的物镜。

2. 制备反应室以使微管黏附于表面

1. 清洗显微镜载玻片以及22 mm × 22 mm盖玻片（用于正置显微镜）或22 mm × 22 mm和18 mm × 18 mm盖玻片（用于倒置显微镜）。根据需要对表面进行修饰。例如，使用碱性洗涤剂（见材料表）清洗盖玻片，中间及之后用100%乙醇和蒸馏水依次洗涤。
2. 使用剃刀刀片和另一张显微镜载玻片作为边缘，切割出3 mm宽的塑料石蜡膜条（见材料表）。
3. 将两条3 mm宽的塑料石蜡膜条平行放置在洁净的22 mm × 22 mm盖玻片上，间距为3 mm。然后放置一张18 mm × 18 mm盖玻片以形成通道。若使用正置显微镜，则将石蜡膜条置于洁净的显微镜载玻片上，再在其上放置一张盖玻片。
4. 将盖玻片（或载玻片）置于100 °C的加热块上加热10–30秒，使石蜡膜熔化并密封形成封闭通道。
5. 通过移液器灌注的方式加入含50 µg/mL抗体的BRB80缓冲液。孵育10分钟。
   注意：我们使用抗罗丹明抗体将罗丹明标记的微管成核种子结合到表面。 alternatively，可使用亲和素（avidin）结合生物素标记的微管成核种子或生物素化的金颗粒。若仅需观察溶液中无微管蛋白存在时的微管（即非动态实验），可使用抗微管蛋白抗体。
6. 用BRB80缓冲液洗涤五次。建议使用0.22 µm滤膜过滤所有溶液。
7. 灌注含1%泊洛沙姆407（一种三嵌段共聚物）的BRB80缓冲液，以阻断表面非特异性结合。孵育10分钟。
8. 用BRB80缓冲液洗涤五次。
9. 样品现已准备就绪，可置于显微镜下观察。为防止样品干燥，在通道两端各加两滴BRB80缓冲液，并在需要时及时补充。

3. 显微镜校准

1. 将样品放置在显微镜载物台上。打开落射照明光源。
2. 对样品表面进行聚焦。由于光路中光学元件对光的背向反射，当物镜上下移动时，您会观察到多个表面。寻找样品表面的一个有效方法是聚焦于石蜡膜边缘。找到表面后，将视场调整至腔室中心。
3. 通过将视场光阑关闭一半并使用调节螺丝，将光阑居中于视场内。对准后，重新打开光阑。
   注意：螺丝调节仅需偶尔进行，大约每3至6个月一次，或在故障排查时进行。
4. 推入伯特兰透镜，以观察物镜的出射光瞳（后焦平面）。
5. 将孔径光阑（AD）关闭至超过物镜出射光瞳边缘的位置。
6. 使用调节螺丝将孔径光阑与出射光瞳居中对齐。通过打开孔径光阑并使其边缘与出射光瞳边缘对齐来再次检查。
   注意：此调节仅需偶尔进行。
7. 将孔径光阑设置为物镜数值孔径（NA）的约2/3。

4. 成像稳定的微管或40 nm金颗粒

注意： 稳定化的微管和金纳米颗粒可作为良好的对照样品。建议首先对表面附着的微管或金纳米颗粒进行成像，以评估干涉反射显微镜（IRM）的性能，并有助于设定最佳的孔径光阑开度（第7节）。

1. 将相机的曝光时间设置为 10 ms，并调节照明强度，使相机的动态范围接近饱和。
2. 通过移液将 10 µL 的 GMPCCP（鸟苷酰基-(α, β)-亚甲基二磷酸）或紫杉醇稳定的微管（或 40 nm 金颗粒）在 BRB80 缓冲液中灌注至新样品，并通过成像观察表面结合情况。当视野中结合了 10–20 根微管后，用 BRB80 缓冲液洗涤样品 2 次。
   注意： 在显微镜对准良好的情况下，无需背景扣除即可观察到微管。
3. 设置时间间隔为 1 秒、持续 10 秒的延时成像（曝光时间为 10 ms），采集 10 幅图像。
4. 采集背景图像。操作方法为：使用载物台控制器或计算机软件沿通道长轴方向移动载物台，同时以无延迟方式连续采集 100 幅图像（即以接近 100 fps、10 ms 曝光）进行实时成像。
   注意： 背景图像为这 100 幅图像的中值。通过取中值，可保留照明分布以及其他静态特征（如光学元件上的灰尘），同时滤除其他动态信号。样品不应存在倾斜，否则在移动载物台时会导致轴向位置变化，从而降低背景图像质量。若无法避免倾斜，则可采用另一种方法：在灌注微管“种子”前，预先采集平均背景图像。
5. 进行图像处理与分析，请进入第 6 步。

5. 成像微管动态

1. 使用脑源性微管蛋白研究微管动态时，将样品加热器温度设置为 37 °C。
2. 通过移液器灌注，向新鲜样品中加入 10 µL 的 GMPCCP 稳定的微管种子（溶于 BRB80 缓冲液），并实时成像观察其与表面的结合情况（即在流动过程中监测）。当视野中已有 10–20 个种子结合后，用 2 倍通道体积的 BRB80 缓冲液清洗样品（BRB80 应预先加热至 37 °C，或至少达到室温）。
   注意：在显微镜对准良好的情况下，无需背景扣除即可清晰观察到微管种子。
3. 灌注聚合反应混合液（7.5 µM 未标记微管蛋白 + 1 mM 鸟苷三磷酸 (GTP) + 1 mM 二硫苏糖醇 (DTT) 溶于 BRB80 缓冲液）。为测量微管生长，使用采集软件设置时间序列，每 5 秒采集一次图像（即 0.2 帧每秒 (fps)），持续 15 分钟。
4. 为增强对比度，每个时间点采集 10 张图像（而非 1 张）并取平均值。对于微管缩短过程，通过将时间延迟设为 0、曝光时间为 10 ms，以 100 fps 采集图像（若使用相机允许，可通过缩小感兴趣区域实现更高的帧率）。
5. 按照步骤 4.4 的方法采集一张背景图像。

6. 图像处理与分析

注意： 本方案在分析时使用 Fiji 软件，但读者可自由选择任何其认为合适的软件。

1. 打开已保存的背景图像。
2. 使用 图像 > 栈 > Z 投影 > 中值 计算中值图像（即背景）。
3. 使用 文件 > 打开 将微管动态视频作为栈打开（非动态微管操作相同）。
4. 使用 处理 > 图像计算器 从栈中减去背景图像。务必勾选“32位（浮点）结果”选项。
5. 对于动态微管，使用 线条工具 沿目标微管绘制一条线，并通过按“t”键将其添加到感兴趣区域管理器中。对所有目标微管重复此操作。
6. 对于动态微管，运行 Multi-Kymo 宏。该宏将为 ROI 管理器中的每根微管生成一个视频和一张线扫描图（kymograph）。每根微管将获得一个唯一的标识符。
7. 对于动态微管，运行 Kymo-Analysis 宏，并按照其步骤测量微管的生长速率和缩短速率。

7. 孔径光阑大小

注意： 使用干涉反射显微镜（IRM）获取微管高对比度图像的一个重要因素是正确设置照明数值孔径（INA）。通过改变入射照明光束在物镜出瞳处的尺寸，可以调节 INA，而该尺寸由光阑孔径（AD）的大小控制（AD 位于物镜出瞳（后焦平面）的共轭平面上，图1）：

其中 DAD 为孔径光阑的直径，f_objective 为物镜的焦距，D_ep 为物镜出瞳直径。通常，在荧光成像时，孔径光阑保持完全打开状态，因此 INA 等于物镜的数值孔径（NA）。在荧光显微镜中，孔径光阑的刻度并不表示其实际直径，因此无法计算 INA。尽管可以通过物镜对孔径光阑的尺寸进行校准，但由于孔径光阑的尺寸会被固定在产生最高对比度的大小，因此这种校准并无必要。

1. 准备固定在表面的荧光标记稳定微管样品（步骤 4.1–4.2）。
   注意：我们使用了四甲基罗丹明标记的微管（激发：550 nm，发射：580 nm）。
2. 使用显微镜调焦旋钮在荧光成像的同时将微管调至清晰（若微管未标记，则使用红外反射显微镜（IRM）或微分干涉差显微镜（DIC）进行成像）。
3. 使用相机软件将相机曝光时间设为 10 ms。
   注意：此曝光时间是任意的，100 ms 的曝光时间同样适用。
4. 将孔径光阑（AD）关闭至最小开孔。调节照明强度，使其接近饱和相机的动态范围或达到最大可能值。
   注意：可参考采集软件通常提供的查找表作为指导。
5. 对包含 10 根以上微管的视野连续采集 10 幅图像（通过连续拍摄或每秒采集一幅图像）。
6. 按照步骤 4.4 的方法采集一幅背景图像。
7. 改变孔径光阑（AD）的大小，并在整个 AD 开口范围（从关闭状态到出瞳尺寸，图 2）内重复步骤 7.5–7.6。每次改变 AD 尺寸时，均需调节照明强度，使其与步骤 7.4 中的强度一致。
8. 对每个采集的视野图像，使用 process > image calculator 减去相应的背景图像，并从下拉菜单中选择“subtract”（减法）。确保勾选“32bit (float) result”（32 位浮点结果）选项。然后使用 image > stack > Z project> average 对所得图像进行平均。
9. 测量微管的信背比（SBR），其定义为微管信号的平均强度（微管强度减去背景强度）除以背景的标准差（图 3）。
10. 通过计算每种开孔尺寸下微管的平均 SBR，确定最佳 AD 尺寸（即最佳 INA），并将 AD 尺寸设定为产生最高 SBR 的值（图 2）。可能存在一段 AD 尺寸范围均可产生相近的对比度。

结果

图1. 干涉反射显微镜（IRM）示意图。（A） 来自光源的落射照明光束穿过孔径光阑后到达50/50分光镜。孔径光阑决定了光束宽度，从而设定了照明的数值孔径（NA）。50/50分光镜将部分光线反射至物镜，用于照射样品。从样品反射的光线被收集后，经管镜投射到相机芯片上，在此处发生干涉并形成图像。图像对比度源于玻璃/水界面反射光（I1）与水/微管界面反射光（I2）之间的干涉效应。根据微管与表面之间的距离（h），I1与I2之间的光程差将导致相长干涉（明亮信号）、相消干涉（暗信号），或介于两者之间的任意状态。例如，若使用波长为600 nm的光进行成像，当微管高度变化约100 nm时，图像对比度将在暗与亮之间切换。星号表示共轭平面。（B） 50/50分光镜安装示例。打开一个合适的滤光片盒，将该分光镜插入通常...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微镜	Nikon	Ti-Eclipse	用于进行实验的倒置显微镜
50/50 分束器	Chroma	21000	购买时请确保选择适合显微镜所用滤光块尺寸的分束器
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris 物镜	Nikon	MRH02902	成像物镜。该物镜具有可调数值孔径（NA）的虹膜，实验中将其打开至 NA 1.3
Mucasol 通用去污剂	Sigma-Aldrich	Z637181-2L	用于清洁盖玻片和载玻片
塑料石蜡膜（商品名 Parafilm M）	Sigma-Aldrich	P7793	用于构建流动通道
抗 TAMRA 抗体	Invitrogen	A-6397	用于将 TAMRA 标记的分子（例如微管）结合到样品表面。RRID (AB_2536196)
Poloxamer 407（商品名 Pluronic F-127）	Sigma-Aldrich		用于封闭通道表面，防止非特异性结合
40 nm 金纳米颗粒	Sigma-Aldrich	753637	用作对照样品
20 nm 金纳米颗粒	Sigma-Aldrich	753610	用作对照样品
Zyla 4.2 相机	Andor	Zyla 4.2	2048×2048 像素（6.5µm 像素尺寸），量子效率为 72%，动态范围为 16 位
Feista 跟踪软件			https://www.bcube-dresden.de/ fiesta/wiki/FIESTA
稳定化微管			实验室自制（参见文中参考文献）