来源：Stormberg, T.，等。利用原子力显微镜成像探究核小体的结构与动力学特性。J. Vis. Exp.(2019)
在本视频中，我们演示了利用静态原子力显微镜观察组装好的核小体。这种高分辨率成像技术可用于研究核小体的结构。
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方法文章
利用静态原子力显微镜观察和表征组装的核小体
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 用于核小体静态原子力显微镜成像的云母表面功能化
- 按所述方法，用去离子水配制 50 mM 1-(3-氨丙基)硅杂恶烷（APS）储备液。将该溶液分装为每份 1 mL，于 4 °C 保存至使用。
注意： 分装的溶液在 4 °C 下可保存一年以上。 - 通过将 50 µL 的 50 mM APS 储备液溶于 15 mL 去离子水（dd H2O）中，配制用于云母修饰的工作浓度 APS 1:300 溶液。
注意： 此工作溶液可在室温下保存数天。 - 从高质量的云母片上切割出 1 × 3 cm 的云母条（所用云母详见 材料表）。
- 检查云母条放入比色皿时是否可对角放置。使用尖头镊子尖端、剃刀刀片或透明胶带剥离云母层，直至两面均新鲜剥离，且厚度约为 0.1 mm（图 1A）。立即将云母片放入盛有 APS 溶液的比色皿中，孵育 30 分钟（图 1B）。
- 将云母片转移至盛有去离子水（dd H2O）的比色皿中，浸泡 30 秒（图 1C）。在氩气气流下彻底吹干 APS 修饰云母条的两面。
注意： 干燥过程中，可使用无纺聚酯纤维洁净室擦拭纸（推荐擦拭纸详见 材料）帮助吸除云母边缘的水分。 - 立即使用干燥的云母条进行样品制备；否则，将云母片存放于洁净干燥的比色皿中（图 1D）。
注意： 若环境湿度较高，建议在真空条件下额外存放 1–2 小时。本实验方案可在此处暂停。
2. 用于静态原子力显微成像的 APS-云母载片上核小体样品的制备
- 将双面胶带贴在多个磁性载物块上，并将其放置在旁边。
- 将APS-云母基底切割成所需尺寸（本实验所用MM型原子力显微镜适用的尺寸为1 × 1 cm的正方形）。将切割好的基底片放入洁净的培养皿中，并保持加盖保存。
- 使用经 0.22 µm 滤膜过滤的缓冲液（含 10 mM HEPES pH 7.5 和 4 mM MgCl）配制组装好的核小体的三种稀释液（终浓度分别为 0.5、1.0 和 2.0 nM）2.
注意： 为避免在低终浓度下核小体发生损失，稀释操作应在APS-云母片沉积前逐个进行，且紧随其后立即完成。 - 将5–10 µL稀释后的核小体样品滴加至APS云母片中心，孵育2分钟。用2–3 mL去离子水轻轻冲洗样品2O，以去除所有缓冲液成分。每次加入约0.5 mL dd H₂O2O 使用时，轻轻摇晃云母以去除多余的冲洗水。
注意： 建议在此冲洗步骤中使用一次性注射器。 - 在洁净的氩气轻流下干燥沉积的样品。
注意： 样品现已准备好进行成像，或可储存于充满氩气的真空柜或干燥器中。按照上述方法制备并储存的样品，在制备一年后成像仍无质量损失。本实验方案可在此处暂停。
3. 核小体的静态原子力显微镜成像
- 将AFM探针安装到探针座上。使用弹簧常数约为40 N/m、共振频率在300至340 kHz之间的探针（参见 材料列表 （针对此处使用的悬臂梁）。
- 将第3节制备的样品固定在原子力显微镜（AFM）载物台上，注意避免接触样品表面。
- 将激光对准悬臂，直至信号总和达到最大，并调节垂直和横向偏转值至接近零。
- 调节原子力显微镜探针以找到其共振频率，并调整驱动振幅，将图像尺寸设置为 100 × 100 nm。点击“接近”按钮以开始接近样品。
- 接近样品后，逐步优化振幅设定值，直至清晰看到样品表面。将扫描尺寸增大至1 × 1 µm，分辨率提高至512 × 512像素。点击捕获按钮，随后点击接近按钮，开始图像采集。
注意： 图像中的 图2 展示成像这些样本时可预期的平滑背景。
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结果
图1： 制备用于核小体AFM成像的APS功能化云母片的流程示意图。 （A）一块厚度约为0.1 mm的云母片两面均被新鲜劈裂。（B）将劈裂后的云母片迅速以对角方式放入含有APS溶液的比色皿中，并在其中孵育30分钟。（C）完成APS功能化后，将APS-云母片转移至盛有去离子水（dd H2O）的比色皿中冲洗30秒。（D）将APS-云母片保存在比色皿中，待后续使用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CENP-A/H4)2，重组人源 | EpiCypher, Durham, NC | 16-0010 | 50 µg 的目录编号 |
| H2A/H2B，重组人源 | EpiCypher, Durham, NC | 15-0311 | 50 µg 的目录编号 |
| H3 八聚体，重组人源 | EpiCypher, Durham, NC | 16-0001 | 50 µg 的目录编号 |
| Slide-A-Lyzer MINI 透析装置套装，10K MWCO，0.1 mL | ThermoFischer Scientific, Waltham, MA | 69574 | 10 个装置的目录编号 |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9888-500G | 500 mg 的目录编号 |
| Amicon Ultra-0.5 mL 离心过滤器 | Millipore-sigma, Burlington, MO | UFC501008 | 8 个装置的目录编号 |
| HCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 258148-25ML | 25 mL 的目录编号 |
| Tricine | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T0377-25G | 25 g 的目录编号 |
| SDS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 11667289001 | 1 kg 的目录编号 |
| 过硫酸铵（AmmPS） | Bio-Rad, Hercules, CA | 1610700 | 10 g 的目录编号 |
| 30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1 | Bio-Rad, Hercules, CA | 1610158 | 500 mL 的目录编号 |
| TEMED | Bio-Rad, Hercules, CA | 1610800 | 5 mL 的目录编号 |
| SDS-PAGE 用 4x Laemmli 蛋白样品缓冲液 | Bio-Rad, Hercules, CA | 1610747 | 10 mL 的目录编号 |
| 2-ME | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M6250-10ML | 10 mL 的目录编号 |
| ageRuler 预染蛋白 Marker | ThermoFischer Scientific, Waltham, MA | 26616 | 500 µL 的目录编号 |
| Bio-Safe™ Coomassie 染色液 | Bio-Rad, Hercules, CA | 1610786 | 1 L 的目录编号 |
| 无纺洁净室擦拭布：TX604 TechniCloth | TexWipe, Kernersvile, NC | TX604 | |
| 云母片（Muscovite Block Mica） | AshevilleMica, Newport News, VA | Grade-1 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | H4034-25G | 25 g 的目录编号 |
| Scotch 胶带 | Scotch-3M, St. Paul, MN | ||
| TESPA-V2 原子力显微镜探针（用于静态成像） | Bruker AFM Probes, Camarillo, CA | ||
| Millex-GP 滤器，0.22 µm | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | SLGP05010 | 10 个装置的目录编号 |
| BL-AC10DS-A2 原子力显微镜探针（用于高速 AFM） | Olympus, Japan | ||
| MultiMode 原子力显微镜 | Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA |
