静态原子力显微镜，用于可视化和表征组装的核小体

Abstract

来源:Stormberg， T. 等人。使用原子力显微镜成像探测核小体的结构和动力学。J. Vis. Exp.（2019 年）

在本视频中，我们演示了静态原子力显微镜来可视化组装的核小体。这种高分辨率成像技术允许研究核小体结构。

Protocol

1. 用于核小体静态 AFM 成像的云母表面功能化

1. 如所述，在去离子水中制备 50 mM 1-（3-氨丙基）silatrane APS 储备液。将 1 mL 等分试样的此溶液在 4 °C 下储存直至使用><。 注意:等分试样可在 4 °C 下储存一年以上。
2. 通过将 50 μL 的 50 mM APS 原液溶解在 15 mL dd H₂O.
   中，制备用于云母修饰的工作 APS 1:300 溶液 注意:该工作溶液可在室温下储存数天。
3. 从优质云母片上切下 1 x 3 cm 的云母条（参见此处使用的云母材料表）。
   1. 检查作品在对角线放入比色皿时是否合适。使用锋利的镊子尖端、剃须刀片或透明胶带劈开云母的层，直到两面都新鲜劈开并且碎片薄至 ~0.1 毫米（图 1A）。立即将云母片放入装满 APS 的比色皿中并孵育 30 分钟（图 1B）。
4. 将云母片转移到装满 dd H 2 O 的比色皿中并浸泡 30 秒（图 1C）。在氩气流下将 APS-云母条的两侧完全干燥。
   注意:无纺纤维素和聚酯洁净室湿巾（推荐擦拭布在材料中详细说明）可用于在干燥时帮助吸走云母边缘的水。
5. 现在使用干云母条进行样品制备。否则，将作品存放在干净、干燥的比色皿中（图 1D><）。 注意:当环境潮湿时，建议在真空中额外存放 1-2 小时。该协议可以在此处暂停。

2. 在 APS-MICA 上制备用于静态 AFM 成像的核小体样品

1. 将双面胶带贴在几个磁性圆盘上，并将它们放在一边。
2. 将 APS-mica 基板切割成所需的尺寸（此处使用的 MM AFM 仪器为 1 x 1 cm 见方）。将这些碎片放入干净的培养皿中并盖上盖子。
3. 使用含有 10 mM HEPES pH 7.5 和 4 mM MgCl₂.
   的 0.22 μm 过滤缓冲液制备组装核小体的三个稀释液（最终核小体浓度为 0.5、1.0 和 2.0 nM） 注意:为了限制低终浓度下核小体的损失，应在沉积到 APS-云母上之前立即一次进行一个稀释。
4. 将 5-10 μL 稀释的核小体样品沉积在 APS-mica 片的中心，并孵育 2 分钟。用 2-3 mL dd H₂O 轻轻冲洗样品，以去除所有缓冲液组分。每使用一次 ~0.5 mL dd H₂O 后，轻轻摇动云母以去除多余的冲洗水。
   注意:建议在此冲洗步骤中使用一次性注射器。
5. 在干净的氩气下干燥沉积的样品。
   注意:样品现在可以进行成像，也可以储存在充满氩气的真空柜或干燥器中。如前所述制备和储存的样品在制备后一年进行成像，无质量损失。该协议可以在此处暂停。

3. 核小体的静态 AFM 成像

1. 将 AFM 探针安装在探针支架上。使用弹簧常数为 ~40 N/m、谐振频率在 300 至 340 kHz 之间的尖端（请参阅此处使用的悬臂的材料表）。
2. 将第 3 节中制备的样品安装在 AFM 载物台上，注意不要接触样品表面。
3. 将激光器放置在悬臂上，直到总和达到最大值，然后将垂直和横向偏转值调整到接近零。
4. 调整 AFM 探针以找到其共振频率并调整驱动幅度并将图像大小设置为 100 x 100 nm。单击 engage 按钮开始该方法。
5. 接近后，逐渐优化振幅设定点，直到清楚地看到样品表面。将扫描尺寸增加到 1 x 1 μm，将分辨率增加到 512 x 512 像素。单击捕获按钮，然后单击参与按钮开始图像采集><。 注意:图 2 中的图像显示了对这些样品进行成像时可以预期的平滑背景。

Results

图 1:制备 APS 功能化云母的过程示意图，用于核小体的 AFM 成像。（A） 一块厚度为 ~0.1 mm 的云母的两面都新鲜切割。（B） 将裂解的云母片立即对角线置于含有 APS 溶液的比色皿中，并设置为孵育 30 分钟。（C） 在 APS 官能化步骤之后，将 APS-云母片转移到装满 dd H 2 O 的比色皿中，冲洗 30 秒。（D） 将 APS-云母片储存在比色皿中直至使用。

图 2:H3 和 CNEP-A 核小体的 AFM 图像示例。（A） 使用静态 AFM 捕获的沉积在 APS-mica 上的 H3 单核小体的样本图像。每个明亮的斑点...

Materials