利用静态原子力显微镜观察和表征组装的核小体

摘要

来源：Stormberg, T.，等。利用原子力显微镜成像探究核小体的结构与动力学特性。J. Vis. Exp.(2019)

在本视频中，我们演示了利用静态原子力显微镜观察组装好的核小体。这种高分辨率成像技术可用于研究核小体的结构。

方案

1. 用于核小体静态原子力显微镜成像的云母表面功能化

1. 按所述方法，用去离子水配制 50 mM 1-(3-氨丙基)硅杂恶烷（APS）储备液。将该溶液分装为每份 1 mL，于 4 °C 保存至使用。
   注意： 分装的溶液在 4 °C 下可保存一年以上。
2. 通过将 50 µL 的 50 mM APS 储备液溶于 15 mL 去离子水（dd H₂O）中，配制用于云母修饰的工作浓度 APS 1:300 溶液。
   注意： 此工作溶液可在室温下保存数天。
3. 从高质量的云母片上切割出 1 × 3 cm 的云母条（所用云母详见 材料表）。
   1. 检查云母条放入比色皿时是否可对角放置。使用尖头镊子尖端、剃刀刀片或透明胶带剥离云母层，直至两面均新鲜剥离，且厚度约为 0.1 mm（图 1A）。立即将云母片放入盛有 APS 溶液的比色皿中，孵育 30 分钟（图 1B）。
4. 将云母片转移至盛有去离子水（dd H2O）的比色皿中，浸泡 30 秒（图 1C）。在氩气气流下彻底吹干 APS 修饰云母条的两面。
   注意：....

结果

图1： 制备用于核小体AFM成像的APS功能化云母片的流程示意图。 （A）一块厚度约为0.1 mm的云母片两面均被新鲜劈裂。（B）将劈裂后的云母片迅速以对角方式放入含有APS溶液的比色皿中，并在其中孵育30分钟。（C）完成APS功能化后，将APS-云母片转移至盛有去离子水（dd H2O）的比色皿中冲洗30秒。（D）将APS-云母片保存在比色皿中，待后续使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CENP-A/H4)2，重组人源	EpiCypher, Durham, NC	16-0010	50 µg 的目录编号
H2A/H2B，重组人源	EpiCypher, Durham, NC	15-0311	50 µg 的目录编号
H3 八聚体，重组人源	EpiCypher, Durham, NC	16-0001	50 µg 的目录编号
Slide-A-Lyzer MINI 透析装置套装，10K MWCO，0.1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	69574	10 个装置的目录编号
氯化钠	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	500 mg 的目录编号
Amicon Ultra-0.5 mL 离心过滤器	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	8 个装置的目录编号
HCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	25 mL 的目录编号
Tricine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	25 g 的目录编号
SDS	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	1 kg 的目录编号
过硫酸铵（AmmPS）	Bio-Rad, Hercules, CA	1610700	10 g 的目录编号
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1	Bio-Rad, Hercules, CA	1610158	500 mL 的目录编号
TEMED	Bio-Rad, Hercules, CA	1610800	5 mL 的目录编号
SDS-PAGE 用 4x Laemmli 蛋白样品缓冲液	Bio-Rad, Hercules, CA	1610747	10 mL 的目录编号
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	10 mL 的目录编号
ageRuler 预染蛋白 Marker	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	26616	500 µL 的目录编号
Bio-Safe™ Coomassie 染色液	Bio-Rad, Hercules, CA	1610786	1 L 的目录编号
无纺洁净室擦拭布：TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, NC	TX604
云母片（Muscovite Block Mica）	AshevilleMica, Newport News, VA	Grade-1
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	25 g 的目录编号
Scotch 胶带	Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 原子力显微镜探针（用于静态成像）	Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Millex-GP 滤器，0.22 µm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	10 个装置的目录编号
BL-AC10DS-A2 原子力显微镜探针（用于高速 AFM）	Olympus, Japan
MultiMode 原子力显微镜	Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA