高速时间序列原子力显微镜捕捉核小体动态

摘要

来源：Stumme-Diers, M. P.，等，利用原子力显微镜成像探究核小体的结构与动力学，J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们展示了高速时间序列原子力显微镜（AFM）成像技术，用于研究核小体复合物的动态过程。当AFM探针扫描核小体表面时，可检测核小体高度的变化，并记录DNA随时间解缠绕的过程。

方案

1. 单核小体的连续稀释组装

1. 生成并纯化一段约400 bp的DNA底物，该底物包含一个偏心的Widom 601核小体定位序列。
   注意： 为限制双核小体的非特异性形成，位于定位序列两侧的每个“臂”长度不应超过约150 bp。
   1. 使用质粒pGEM3Z-601及设计的引物，通过PCR扩增底物DNA。对于本实验中使用的423 bp底物（臂长分别为122 bp和154 bp），采用正向引物（5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3'）和反向引物（5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'）。
   2. 将含有反应混合物的试管加入预热至95℃的PCR仪中 °C. 初始变性：95℃下5分钟，随后进行33个循环的下列程序 °C：95℃ 变性 30 秒 °C，49℃退火30秒 °C，以及72℃延伸35秒 °C. 在72℃下进行最终延伸扩增 °33个循环后，于C条件下反应10分钟。
   3. 使用市售的PCR纯化试剂盒从PCR混合物中纯化DNA。从PCR纯化柱洗脱DNA时，使用10 mM Tris缓冲液（pH 7.5）替代试剂盒提供的洗脱缓冲液。
      注意： 在纯化步骤之间需格外注意，避免缓冲液的交叉转移。被污染的洗脱液可能在测定DNA浓度时引发下游问题，和/或改变核小体组装混合物的起始盐浓度。
2. 通过测量纯化后DNA在260 nm处的吸光度来确定DNA浓度。
   1. 使用10 mM Tris pH 7.5洗脱缓冲液在紫外-可见分光光度计上采集空白对照。然后测定纯化DNA的吸光度。
3. 浓度确定后，取25 pmol纯化后的DNA加入0.6 mL离心管中，置于真空离心浓缩仪中浓缩至溶液即将不可见，通常需要30分钟至1小时。
   注意： DNA底物现已准备好用于核小体组装。否则，可在本步骤暂停实验流程，并将DNA储存于-20℃ °C，直至使用。
4. 将含有25 pmol DNA的微量离心管置于冰上，并依次加入核小体组装组分 表1，按所列顺序添加。所有组分加完后，将混合物从冰上取出，在室温（RT）孵育30分钟。
   注意： 在计算达到 2 M 终浓度所需的 NaCl 时，必须考虑储备组蛋白缓冲液中的盐含量。
5. 通过连续梯度稀释法将混合物中的盐浓度从2 M降低至200 mM，从而组装核小体。
   1. 用注射器吸取100 µ含有10 mM Tris（pH 7.5）的稀释缓冲液，置于注射泵上。
   2. 将注射器针头穿过微量离心管管盖上预先打好的孔，确保与组装混合物接触（图1).
   3. 以 0.75 的速率运行注射泵 µL/min，持续120分钟。
      注意： 所得的100 µL 溶液含有 250 nM 核小体和 200 mM NaCl。
   4. 将混合物转移至10 K MWCO透析袋中，用200 mL预冷（4℃）的透析缓冲液在4℃下透析至少4小时。 °C) 低盐缓冲液（含10 mM Tris pH 7.5、0.25 mM EDTA 和 2.5 mM NaCl），4℃孵育1小时 °C.
6. 为评估核小体组装中的组蛋白含量，按照先前所述方法制备不连续SDS-PAGE凝胶，分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为6%。
   1. 分装 10 - 20 µ将适量核小体储备液加入微量离心管中，加入4×Laemmli上样缓冲液，使其工作浓度为1–2×。
   2. 作为对照，在另一个微量离心管中重复此制备步骤，进行 1 - 2 次 µg 组蛋白储备液。将样品在 95 °约 5 分钟，温度为 C
   3. 将样品加样至凝胶上相邻的泳道中。在未使用的泳道中加入上样缓冲液，以促进条带均匀迁移。
   4. 以65 V电压电泳，直至染料前沿通过浓缩胶。当到达分离胶时，将电压升至150 V，继续电泳至染料前沿完全迁出凝胶。
   5. 拆卸电泳装置，并将凝胶轻轻转移至盛有dd H₂O的染色容器中₂O. 将凝胶在轻柔振荡下静置5分钟。用新鲜的dd H₂O重复此步骤两次。₂每次均使用 O。
      注意： 本方案中使用的考马斯亮蓝染色无需典型的考马斯亮蓝染色固定步骤（参见 材料表）如果使用其他考马斯亮蓝染色试剂，请根据需要调整固定步骤。
   6. 移除最后一次漂洗的水，并加入足量染色液以覆盖凝胶。在轻柔振荡条件下使凝胶染色至少1小时。
      注意： 染色过程中，可将染色容器置于任何能够促进染料在凝胶表面流动并同时保持凝胶完全浸没于液体中的装置上。
   7. 从容器中移除染色液，并用dd H₂O冲洗凝胶₂O. 更换 dd H₂O，并在温和振荡下浸泡凝胶30分钟。（凝胶应呈现如图所示的状态） 图2，组蛋白条带分离清晰。
7. 将核小体在 4 ℃ 下保存 °C，直至使用。
   注意： 在这些条件下储存时，核小体可保持数月稳定。本实验方案可在此处暂停。

2. 核小体动力学的高速时间分辨原子力显微镜成像

注意：以下方案适用于由安藤组（日本金泽大学，金泽）开发的高速原子力显微镜（HS-AFM）仪器。

1. 制备APS-云母用于液体成像
   1. 使用玻璃棒-扫描仪胶将玻璃棒固定在原子力显微镜（AFM）扫描仪载物台上（参见 材料表）。让其干燥至少10分钟。
   2. 使用打孔法从较大的云母片上制备直径为1.5 mm、厚度约为0.1 mm的圆形云母片。采用HS-AFM云母-玻璃棒胶（见 材料表) 将此云母片粘附至高速原子力显微镜（HS-AFM）的玻璃棒上，并静置干燥至少10分钟，期间勿触碰。使用压敏胶带剥离云母层，直至在胶带上观察到良好剥离的云母层。
   3. 稀释1 µ99 中加入 50 mM APS 储液 L µdd H₂O 的升数₂O以制备500 µM APS 溶液。加入 2.5 µ将该溶液 L 滴加到新解理的云母表面，室温下孵育 30 分钟以完成功能化。
      注意： 为防止功能化过程中表面干燥，可将50 mL圆锥形离心管的管盖内放置一片湿润的滤纸，并将其盖在扫描仪上。与静态成像相比，液体成像时APS储备液的稀释倍数减少3倍，以控制反应动力学速率至可在原子力显微镜（AFM）下观察的程度。
   4. 用20冲洗云母 µdd H₂O 的升数₂O 通过应用多个约 3 µL 次洗涤。每次洗涤后，将无纺布擦拭纸置于云母边缘以彻底去除水分。最后一次洗涤后，加入约 3 µdd H₂O 的升数₂O 表面，静置至少 5 分钟，以去除任何非特异性结合的 APS。
2. 将探针放入高速原子力显微镜（HS-AFM）探针 holder 中，并将 holder 置于 AFM 样品台上，使探针尖端朝上。用约 100 μL 超纯水冲洗 holder。 µdd H₂O 的升数₂O 后接两个约 100 µ0.22 的 L 次洗涤 µ含10 mM HEPES（pH 7.5）和4 mM MgCl的微孔滤膜过滤核小体成像缓冲液₂.
3. 冲洗完毕后，向腔室中加入约100 µ核小体成像缓冲液 L，浸没尖端。调整悬臂位置，直至其被激光照射。用 20 体积 APS-云母冲洗 µL 过滤后的核小体成像缓冲液，使用约 4 µL 每次洗涤
4. 稀释1 µ将核小体组装储备液加入至250 L µL 过滤后的核小体成像缓冲液，使核小体终浓度为 1 nM。加入 2.5 µ将此稀释液 2 分钟。用约 4 mL 的水冲洗表面 µ用核小体成像缓冲液冲洗表面两次。最后一次冲洗后，保持表面覆盖成像缓冲液。
   注意： 若在沉积核小体样品后未冲洗表面，表面将迅速变得过度拥挤。
5. 将扫描仪和样品放置在探针架顶部，使样品朝下。开始接近时，使用自动接近功能，并设置设定点振幅 A_s 接近自由振荡幅度 A₀.
   注意： 理想情况下，A_s = 0.95 A₀，然而，在A的82%下运行₀ 如果操作谨慎，同样可行。
6. 调节设定点，直至表面被良好追踪。
   注意： 为尽量减少原子力显微镜针尖向核小体样品传递能量，应保持悬臂的振幅较小，最低可达1 nm的振幅为最佳。
7. 将成像区域设置为约150 × 150 nm至200 × 200 nm，数据采集速率为每帧成像约300 ms。
   注意： 该图像尺寸通常足以同时捕捉多个核小体的动力学行为。若表面颗粒密度较低，可能需要调整这些参数。建议的帧率足以捕捉核小体的各种动力学过程，如成环、滑动和解缠绕等（参见 代表性结果 如下所述部分）。

表1：连续盐梯度核小体组装所需的试剂。 表中列出的每种组分均需加入含有纯化DNA的微量离心管中。添加顺序应与表中试剂的列出顺序一致，先加入水和NaCl，随后加入H2A/H2B二聚体，最后加入组蛋白四聚体。若使用预先折叠的组蛋白八聚体，则应以上述四聚体的相同比例加入。*请注意各组蛋白储备液中的NaCl含量，并相应调整5 M NaCl的加入量，最终[NaCl]应为2 M。（参见材料表）。

结果

图1：用于微尺度核小体组装的注射泵示意图。 组装混合物被放置在与注射器针头末端接触的位置。随着注射泵将稀释缓冲液输送至组装混合物中，NaCl浓度逐渐降低，从而促进核小体的组装。该图改编自Stumme-Diers et al。

图 2：组装核小体的 SDS-PAGE 分析。 第 1 道和第 2 道分别含有 H3 八聚体和 CENP-A 组...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
质粒 pGEM3Z-601	Addgene，马萨诸塞州剑桥市	26656
PCR引物	IDT，爱荷华州科拉尔维尔	定制订单	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3''<br/> (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq 聚合酶	ThermoFischer Scientific，Waltham，MA	EP0701	200单位的产品目录编号
PCR 纯化试剂盒	Qiagen，德国希尔登&nbsp;	28104	50个单位的目录编号
Tris 碱	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯市	10708976001	250 g 产品目录编号
EDTA	ThermoFischer Scientific，Waltham，MA	15576028	500 g 产品目录编号
(CENP-A/H4)2，重组人源	EpiCypher，美国北卡罗来纳州达勒姆	16-0010	50 μg 产品目录编号
H2A/H2B，重组人源	EpiCypher，美国北卡罗来纳州达勒姆	15-0311	50 μg 产品目录编号
H3 八聚体，重组人源	EpiCypher，北卡罗来纳州达勒姆	16-0001	50 μg 产品目录编号
Slide-A-Lyzer MINI 透析装置套件，10K 截留分子量，0.1 mL	ThermoFischer Scientific，Waltham，MA	69574	10个设备的目录编号
氯化钠	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	S9888-500G	500 mg 的目录编号
Amicon Ultra-0.5&nbsp;mL 离心过滤器&nbsp;	Millipore-Sigma，Burlington，MO	UFC501008	8个设备的目录编号
HCl	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	258148-25ML	25 mL 产品目录编号
Tricine	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	T0377-25G	25 g 产品目录编号
SDS	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	11667289001	1 千克的目录编号
过硫酸铵（AmmPS）&nbsp;	Bio-Rad，Hercules，CA	1610700	10 g 产品目录编号
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1	Bio-Rad，Hercules，CA	1610158	500 mL 产品的目录编号
TEMED	Bio-Rad，Hercules，CA	1610800	5 mL 的目录编号
4x Laemmli 蛋白上样缓冲液（用于 SDS-PAGE）	Bio-Rad，Hercules，CA	1610747	10 mL 产品目录编号
2-ME	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	M6250-10ML	10 mL 产品目录编号
PageRuler 预染蛋白标记&nbsp;	ThermoFischer Scientific，Waltham，MA	26616	500 µL 产品目录编号
生物安全&trade; 考马斯亮蓝染色	Bio-Rad，Hercules，CA	1610786	1 升装产品目录编号
非织造洁净室擦拭布：TX604 TechniCloth&nbsp;	TexWipe，北卡罗来纳州凯尔纳维尔	TX604
云母块（Muscovite Mica）	阿什维尔云母，纽波特纽斯，弗吉尼亚州	1级
氨基丙基硅杂环戊烷（APS）	如文献22所述进行合成
HEPES	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	H4034-25G	25 g 产品目录编号
透明胶带	Scotch-3M，美国明尼苏达州圣保罗市
Aron Alpha 工业速干胶	Toagosei America，美国俄亥俄州西杰斐逊	AA480	2 g 离心管的货号
MgCl2	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	M8266-100G	100 克产品的目录编号
Millex-GP 滤器，0.22&nbsp;&micro;m	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	SLGP05010	10个设备的目录编号
BL-AC10DS-A2 原子力显微镜探针（用于高速原子力显微镜）	奥林巴斯，日本
化合物 FG-3020C-20&nbsp;	日本爱知县春日井市鹿岛屋，富罗科技有限公司&nbsp;
化合物 FS-1010S135-0.5&nbsp;	日本爱知县春日井市鹿岛屋，富罗科技有限公司&nbsp;
高速时间分辨原子力显微镜	Toshio Ando，金泽大学纳米生命科学研究所，日本金泽市角间町