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高速时间序列原子力显微镜捕捉核小体动态

2025年7月8日

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

来源：Stumme-Diers, M. P.，等，利用原子力显微镜成像探究核小体的结构与动力学，J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们展示了高速时间序列原子力显微镜（AFM）成像技术，用于研究核小体复合物的动态过程。当AFM探针扫描核小体表面时，可检测核小体高度的变化，并记录DNA随时间解缠绕的过程。

方案

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1. 单核小体的连续稀释组装

  1. 生成并纯化约 400 bp 的 DNA 底物，该底物包含偏心 Widom 601 核小体定位序列。
    注意:为了限制不需要的二核小体形成，定位序列两侧的每个"臂"不应超过 ~150 bp。
    1. 使用质粒 pGEM3Z-601 和设计的引物，并使用 PCR 扩增底物 DNA。对于此处使用的臂长为 122 和 154 bp 的 423 bp 底物，使用正向 （5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3'） 和反向 （5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'） 引物。
    2. 将含有反应混合物的试管加入预热至95°C的热循环仪中。在95°C下初始变性5分钟后，运行以下程序33个循环:95°C下30秒变性，49°C下退火30秒，72°C下延伸35秒。33 个循环后，将最终延伸设置在 72°C 下 10 分钟。
    3. 使用市售的 PCR 纯化试剂盒从 PCR 混合物中纯化 DNA。从 PCR 纯化柱洗脱 DNA 时，使用 10 mM Tris 缓冲液 （pH 7.5） 代替试剂盒提供的洗脱缓冲液><。 注意:请格外小心，不要在纯化步骤之间转移缓冲液。在测量 DNA 浓度时，受污染的洗脱液可能会导致下游问题和/或改变核小体组装混合物的起始盐浓度。
  2. 通过测量....

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结果

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用于色谱和PCR实验中精确液体处理的实验室注射泵。
图1：用于微尺度核小体组装的注射泵示意图。 组装混合物被放置在与注射器针头末端接触的位置。随着注射泵将稀释缓冲液输送至组装混合物中，NaCl浓度逐渐降低，从而促进核小体的组装。该图改编自Stumme-Diers et al。

蛋白质电泳结果；组蛋白复合物示意图；标有分子量标记。
图 2：组装核小体的 SDS-PAGE 分析。 第 1 道和第 2 道分别含有 H3 八聚体和 CENP-A 组.......

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材料

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 质粒 pGEM3Z-601 Addgene， 剑桥， 马萨诸塞州 26656 PCR 引物 IDT，爱荷华州克拉尔维尔 定制订单 （FP） 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3'
（RP） 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3' DreamTaq 聚合酶 ThermoFischer Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆 编号 EP0701 200 个单位的货号 PCR 纯化试剂盒 Qiagen， Hilden， 德国 28104 50 件的货号 Tris 碱 Sigma-Aldrich， 密苏里州圣路易斯 10708976001 250 g 的货号 乙二胺四乙酸 ThermoFischer Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆 15576028 500 g 的货号 （CENP-A/H4）2，重组人 EpiCypher，北卡罗来纳州达勒姆 编号:16-0010 50 ug 的货号 重组人 H2A/H2B EpiCypher，北卡罗来纳州达勒姆 编号:15-0311 50 ug 的货号 H3 Octamer，重组人 EpiCypher，北卡罗来纳州达勒姆 邮编:16-0001 50 ug 的货号 Slide-A-Lyzer MINI 透析装置套装，10K MWCO，0.1 mL ThermoFischer Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆 69574 10 设备的货号 氯化钠 Sigma-Aldrich， 密苏里州圣路易斯 S9888-500G 系列 500 mg 的货号 Amicon Ultra-0.5 mL 离心过滤器 Millipore-sigma，密苏里州伯灵顿 UFC501008 8 设备的目录号 盐酸 Sigma-Aldrich， 密苏里州圣路易斯 258148-25 毫升 25 mL 的货号 特里辛 Sigma-Aldrich， 密苏里州圣路易斯 T0377-25G 25 g 的货号 安全数据表 Sigma-Aldrich， 密苏里州圣路易斯 11667289001 1 kg 的货号 过硫酸铵 （AmmPS） Bio-Rad，加利福尼亚州赫拉克勒斯 1610700 10 g 的货号 30% 丙烯酰胺/双溶液，37.5:1 Bio-Rad，加利福尼亚州赫拉克勒斯 1610158 500 mL 的货号 特梅德 Bio-Rad，加利福尼亚州赫拉克勒斯 1610800 5 mL 的货号 4x Laemmli 蛋白质样品缓冲液，用于 SDS-PAGE Bio-Rad，加利福尼亚州赫拉克勒斯 1610747 10 mL 的货号 2-ME Sigma-Aldrich， 密苏里州圣路易斯 M6250-10毫升 10 mL 的货号 PageRuler 预染蛋白分子量标准 ThermoFischer Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆 26616 500 μL 的货号 Bio-Safe™ 考马斯染色剂 Bio-Rad，加利福尼亚州赫拉克勒斯 1610786 1 L 的货号 无纺布洁净室湿巾:TX604 TechniCloth TexWipe，北卡罗来纳州克纳斯维尔 TX604 系列 白云母块状云母 AshevilleMica，弗吉尼亚州纽波特纽斯 1 级 氨丙基 silatrane （APS） 按照 22 中的描述进行合成 HEPES 系列 Sigma-Aldrich， 密苏里州圣路易斯 H4034-25G 25 g 的货号 胶带 Scotch-3M， 明尼苏达州圣保罗 Aron Alpha Industrial Krazy 胶水 Toagosei America， West Jefferson， OH （俄亥俄州西杰斐逊） AA480 型 2 g 离心管的货号 氯化镁2 Sigma-Aldrich， 密苏里州圣路易斯 货号 M8266-100G 100 g 的货号 Millex-GP 过滤器，0.22 μm Sigma-Aldrich， 密苏里州圣路易斯 SLGP05010 10 设备的货号 BL-AC10DS-A2 原子力显微镜探针 （用于 HS-AFM） Olympus， 日本 化合物 FG-3020C-20 FluoroTechnology Co.， Ltd.， Kagiya， Kasugai， 爱知县， 日本 化合物 FS-1010S135-0.5 FluoroTechnology Co.， Ltd.， Kagiya， Kasugai， 爱知县， 日本 高速延时原子力显微成像 Toshio Ando，日本金泽市卡库马町金泽大学纳米生命科学研究所

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DNA

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