透射电子显微镜定量分析人体骨骼肌中糖原分布

摘要

来源：Jensen, R.，等。利用透射电子显微镜定量分析骨骼肌纤维中亚细胞糖原分布。J. Vis. Exp. (2022)

在本视频中，我们演示了人类骨骼肌组织样本的制备及其透射电子显微镜染色方法，以观察和定量亚细胞水平的糖原分布。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查

1. 初级固定、后固定、包埋、切片与染色

1. 在2 mL微量离心管中配制1.6 mL初级固定液（含2.5%戊二醛的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.3），于5 °C保存，最长不超过14天。
2. 从肌肉活检组织或整块肌肉中分离出一小块样本，其任意方向的最大直径不超过1 mm，且在纵向纤维方向上略长于横截面方向（以便定位）。
3. 将样本放入含有冷初级固定液的离心管中，于5 °C固定24小时。
4. 用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.3）在室温下清洗样本四次（每次间隔15分钟）。使用移液器吸出废液，注意不要扰动样本，随后加入新鲜缓冲液。
   注意：最后一次清洗后，样本可在0.1 M二甲胂酸钠缓冲液中于5 °C保存数月。本步骤可作为暂停点。
5. 在0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.3）中加入1%四氧化锇（OsO₄）和1.5%亚铁氰化钾（K₄Fe(CN)₆），于4 °C后固定120分钟。
   注意：使用1.5%亚铁氰化钾（K₄Fe(CN)₆）对糖原颗粒的对比度优化至关重要。
6. 在室温下用双蒸水漂洗两次。
7. 在室温下依次浸入梯度浓度的醇类（乙醇）进行脱水处理，具体浓度和时间为：70%（10分钟）、70%（10分钟）、95%（10分钟）、100%（10分钟）、100%（10分钟）。
   注意：每一步均将样本浸入乙醇，随后仅部分移除液体以避免样本干燥，最后弃去残留乙醇。
8. 在室温下使用环氧丙烷与环氧树脂的梯度混合液进行渗透处理，体积比依次为：1/0（10分钟）、1/0（10分钟）、3/1（45分钟）、1/1（45分钟）、1/3（45分钟）、0/1（过夜）。次日将样本转移至模具中，用100%新鲜环氧树脂包埋，并于60 °C聚合48小时。
9. 对纵向排列的纤维切取超薄切片（60–70 nm），并按以下步骤收集至单孔铜网上。
   1. 将样本块固定在超薄切片机的样品夹上。
   2. 用剃刀片修整样本块表面，直至暴露组织层面。
   3. 在样本前方安装金刚石刀（ultra cut 45），并对齐样本表面与刀刃平行。
   4. 使用金刚石刀切取半薄切片（1 µm）以检查样本方向，并用甲苯胺蓝染色后在光学显微镜下观察。
   5. 进一步修块，缩小目标区域，以便获得合适的超薄切片。
   6. 使用第二把金刚石刀（ultra cut 45）切取超薄切片（60–70 nm）。
   7. 使用Perfect Loop将1–2片切片收集至单孔铜网上。
      注意：单孔铜网中央有一个孔，配有Formvar支持膜。
10. 将上述载网浸入醋酸铀溶液（0.5%溶于双蒸水）中染色20分钟，再浸入柠檬酸铅溶液（1%溶于双蒸水）中染色15分钟，以进行双重染色。两次染色之间及染色结束后均需用双蒸水漂洗载网。
    注意：本步骤可作为暂停点。

2. 成像

1. 开启透射电子显微镜（工作加速电压为 80 kV）、计算机及图像采集软件。使用数字慢扫描 2 k × 2 k CCD 相机及其配套成像软件记录数字图像。
2. 将带有多个切片的载网插入显微镜样品台。
3. 首先在低倍率（例如 ×100）下对载网进行扫描，以评估切片质量（如支撑膜上的孔洞、杂质等），并选择质量最佳的切片区。在低倍率下确定肌纤维的走向。
4. 接着，将电子束对准切片中一个边缘区域的肌纤维，并逐步提高放大倍数。在放大倍数超过 30 k 时进行图像聚焦，以确保图像中包含足够的精细结构细节，并可借助实时快速傅里叶变换（如具备该功能）进行辅助判断。最后，在目标放大倍数下以 1 秒曝光时间采集图像。
5. 对随机选取的一个肌纤维，共采集 24 张图像，其中肌原纤维区域 12 张，肌膜下区域 12 张，放大倍数范围为 10 k 至 40 k。确保图像在肌纤维的长度和宽度方向上以随机但系统化的方式分布，以获得无偏结果（图 1A）。
   注意： 最佳放大倍数取决于相机分辨率和照片尺寸。目标是实现最终分辨率，使得糖原颗粒直径可在 1 nm 步长下进行测量，并确保所分析的肌原纤维区域总面积至少为 70 µm²，纤维总长度至少为 25 µm，分别均匀分布于每根纤维的 12 张肌原纤维区域图像和 12 张肌膜下区域图像中。每根纤维采集 24 张图像，通常可使人体、大鼠和小鼠骨骼肌单个肌纤维中不同糖原池体积含量的精确度（误差系数）达到 0.1 至 0.2 之间（图 2E）。
6. 重复步骤 2.4 和 2.5，直至共完成 6–10 根肌纤维的成像。如有需要，可制备额外切片（相邻切片间距至少 150 µm，以避免已成像纤维的重叠），并重复步骤 1.9–2.5。

3. 图像分析

1. 通过单击将图像导入 ImageJ 文件 > 打开.
2. 通过单击将全局比例设置为与图像原始尺寸匹配 分析 > 设置比例尺.
3. 通过点击将视图放大100% 图像 > 缩放 > 在.
4. 使用图像中肌原纤维区域的每个Z线（每根纤维12个）测量其厚度 直线 从“工具”菜单中选择工具（图1D计算每根6-10条肌纤维的平均Z线厚度。
5. 将平均Z线最厚的2-3根纤维定义为Ⅰ型纤维，将平均Z线最薄的2-3根纤维定义为Ⅱ型纤维。其余中间的2-4根纤维不纳入后续分析。图1E).
   注意：以下步骤需对样本中的每根纤维（共4-6根）重复进行。糖原体积分数通过点计数法估算。网格大小的选择应确保估算结果具有足够高的精确度，通常需达到250次击中（hits），由此确定所需的总点数以及每个点所代表的面积。
6. 使用 分段线 用于测量紧邻肌膜下区域下方可见的最外层肌原纤维长度的工具（图2A).
   注意： 该长度用于表示单位表面积下的肌膜下糖原含量（即最外层肌原纤维的长度乘以切片厚度（60 nm）；参见步骤4.5）。因此，分析仅包含由该长度所代表的肌膜下区域。
7. 单击以插入网格 分析 > 工具 > 网格 并设置 每点面积 在 32,400 nm 处²在12张肌膜下图像中，统计可利用长度范围内与肌膜下糖原相交的横线数目，图2A命中定义为十字交叉的右上角存在糖原颗粒。
8. 单击以插入网格 分析 > 工具 > 网格 并设置 每点面积 在 160,000 nm 处². 统计12张肌原纤维图像中穿过肌原纤维内空间的十字交叉点数量（图2B).
9. 单击以插入网格 分析 > 工具 > 网格 并设置 每点面积 在3,600 nm²范围内，统计12张肌原纤维图像中十字交叉与肌原纤维内糖原相交的次数。图2C).
10. 单击以插入网格 分析 > 工具 > 网格 并设置 每点面积 在 32,400 nm 处²统计12张肌原纤维图像中与肌原纤维间糖原相交的十字交叉数量图 2D).
11. 使用 直线 使用工具，从每张图像的每个池中随机选取五个糖原颗粒测量其直径，共测量12张图像，以获得每池每根肌纤维平均60个颗粒的数据。
    注意：60 个颗粒的平均值已基本涵盖纤维内部的变异情况图 2F).

结果

图1： 成像与纤维分型。 （A）每根肌纤维均按随机系统顺序成像。（B）肌膜下区域图像示例。（C）肌原纤维区域图像示例。（D）在每张肌原纤维图像中测量一个Z线的宽度（红线）。共测量12个Z线（每张图像一个），得到的误差系数约为0.03。（E）10例活检样本中，每例6-10根纤维的平均Z线宽度的典型分布。根据每例活检内部的分布情况，从每例活检中确定2-3根纤维为1型和2型。图像来源于此前一项研究中一名举重运动员的股外侧肌活检样本。m：线粒体；Z：Z线。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-丙烯氧化物	Merck	75-56-9
Embedding 812 树脂包埋介质试剂盒	Taab	T031
25% 戊二醛溶液	Merck	1.04239.0250
ITEM	Olympus		成像软件
Leica EM AC20	Leica		自动染色系统
OSIS Veleta 数字相机	Olympus
4% 四氧化锇溶液	Polysciences	0972A
Philips CM 100 透射电子显微镜	Philips
六氰合铁(II)酸钾三水合物	Sigma-Aldrich	455989-245G
0.2 M pH 7.4 二甲胂酸钠缓冲液	Ampliqon.com	AMPQ40989.0500
Leica UC7 超薄切片机	Leica
稳定化的 3% 柠檬酸铅超染液（Ultrostain）	Leica	16707235
乙酸铀酰二水合物	Polysciences	6159-44-0