透射电子显微镜定量分析人体骨骼肌中糖原分布

摘要

来源：Jensen, R.，等。利用透射电子显微镜定量分析骨骼肌纤维中亚细胞糖原分布。J. Vis. Exp. (2022)

在本视频中，我们演示了人类骨骼肌组织样本的制备及其透射电子显微镜染色方法，以观察和定量亚细胞水平的糖原分布。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查

1. 初级固定、后固定、包埋、切片与染色

1. 在2 mL微量离心管中配制1.6 mL初级固定液（含2.5%戊二醛的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.3），于5 °C保存，最长不超过14天。
2. 从肌肉活检组织或整块肌肉中分离出一小块样本，其任意方向的最大直径不超过1 mm，且在纵向纤维方向上略长于横截面方向（以便定位）。
3. 将样本放入含有冷初级固定液的离心管中，于5 °C固定24小时。
4. 用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.3）在室温下清洗样本四次（每次间隔15分钟）。使用移液器吸出废液，注意不要扰动样本，随后加入新鲜缓冲液。
   注意：最后一次清洗后，样本可在0.1 M二甲胂酸钠缓冲液中于5 °C保存数月。本步骤可作为暂停点。
5. 在0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.3）中加入1%四氧化锇（OsO₄）和1.5%亚铁氰化钾（K₄Fe(CN)₆），于4 °C后固定120分钟。
   注意：使用1.5%亚铁氰化钾（K₄Fe(CN)₆）对糖原颗粒的对比度优化至....

结果

图1： 成像与纤维分型。 （A）每根肌纤维均按随机系统顺序成像。（B）肌膜下区域图像示例。（C）肌原纤维区域图像示例。（D）在每张肌原纤维图像中测量一个Z线的宽度（红线）。共测量12个Z线（每张图像一个），得到的误差系数约为0.03。（E）10例活检样本中，每例6-10根纤维的平均Z线宽度的典型分布。根据每例活检内部的分布情况，从每例活检中确定2-3根纤维为1型和2型。图像来源于此前一项研究中一名举重运动员的股外侧肌活检样本。m：线粒体；Z：Z线。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-丙烯氧化物	Merck	75-56-9
Embedding 812 树脂包埋介质试剂盒	Taab	T031
25% 戊二醛溶液	Merck	1.04239.0250
ITEM	Olympus		成像软件
Leica EM AC20	Leica		自动染色系统
OSIS Veleta 数字相机	Olympus
4% 四氧化锇溶液	Polysciences	0972A
Philips CM 100 透射电子显微镜	Philips
六氰合铁(II)酸钾三水合物	Sigma-Aldrich	455989-245G
0.2 M pH 7.4 二甲胂酸钠缓冲液	Ampliqon.com	AMPQ40989.0500
Leica UC7 超薄切片机	Leica
稳定化的 3% 柠檬酸铅超染液（Ultrostain）	Leica	16707235
乙酸铀酰二水合物	Polysciences	6159-44-0