利用扫描电子显微镜定量分析膜皱褶的形成

摘要

来源：Ahn, W. 等，利用扫描电子显微镜观察膜皱褶的形成 J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了使用扫描电子显微镜（SEM）对表现出膜皱褶的巨噬细胞进行样品制备、固定及成像的过程。关于膜形态和结构的详细信息对于理解细胞的生理状态至关重要。

方案

1. 细胞系与细胞培养

1. 在含有10%（体积比）热灭活胎牛血清（FBS）、100 IU/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养RAW 264.7巨噬细胞，置于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中。每隔一天更换一次培养基。
2. 当细胞融合度达到80%时，使用无菌PBS洗涤培养板两次。
3. 加入1,000 µL 0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C湿化培养箱中孵育3–5分钟以解离细胞。
4. 在光学显微镜下观察培养板，确认细胞已解离。加入含10% FBS的10 mL完全培养基以中和胰蛋白酶活性。
5. 将细胞悬液收集至50 mL锥形管中，室温下以400 x g 离心5分钟。用完全细胞培养基轻柔重悬细胞，并使用台盼蓝（0.4%）染色法测定细胞数量和活力。
   注意：本实验建议的最低细胞活力为>90%。
6. 使用经高压灭菌的镊子将无菌玻璃盖玻片放入24孔板的孔中。以1 × 10⁶ 个细胞/mL的密度将细胞接种于盖玻片上，并在37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育过夜。
7. 处理前，每孔更换为500 µL新鲜完全培养基。用溶剂对照（DMSO或其他用于溶解EIPA的溶剂）或巨胞饮抑制剂5....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	15400-054
2% 戊二醛	Electron Microscopy Sciences	16320
4% 多聚甲醛	Santa Cruz Biotechnology	281692
5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利	Sigma Life Science	A3085
碳胶粘附垫	Electron Microscopy Sciences	77825-09
二甲基亚砜	Corning	25-950-CQC
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24孔透明平底TC处理多孔细胞培养板	Falcon	353047
胎牛血清	Gemini Bio	900-108
HERAcell 150i CO2 培养箱	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 溅射镀膜仪	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR 扫描电子显微镜
显微镜盖玻片	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
佛波醇12-十四烷酰-13-乙酸酯	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 巨噬细胞	ATCC	ATCC TIB-71
重组人M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 临界点干燥仪	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM 铝制样品台	Electron Microscopy Sciences	75220
二甲胂酸钠	Electron Microscopy Sciences	12300
台盼蓝溶液	Thermo Fisher Scientific	15250061