利用扫描电子显微镜定量分析膜皱褶的形成

摘要

来源：Ahn, W. 等，利用扫描电子显微镜观察膜皱褶的形成 J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了使用扫描电子显微镜（SEM）对表现出膜皱褶的巨噬细胞进行样品制备、固定及成像的过程。关于膜形态和结构的详细信息对于理解细胞的生理状态至关重要。

方案

1. 细胞系与细胞培养

1. 在含有10%（体积比）热灭活胎牛血清（FBS）、100 IU/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养RAW 264.7巨噬细胞，置于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中。每隔一天更换一次培养基。
2. 当细胞融合度达到80%时，使用无菌PBS洗涤培养板两次。
3. 加入1,000 µL 0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C湿化培养箱中孵育3–5分钟以解离细胞。
4. 在光学显微镜下观察培养板，确认细胞已解离。加入含10% FBS的10 mL完全培养基以中和胰蛋白酶活性。
5. 将细胞悬液收集至50 mL锥形管中，室温下以400 x g 离心5分钟。用完全细胞培养基轻柔重悬细胞，并使用台盼蓝（0.4%）染色法测定细胞数量和活力。
   注意：本实验建议的最低细胞活力为>90%。
6. 使用经高压灭菌的镊子将无菌玻璃盖玻片放入24孔板的孔中。以1 × 10⁶ 个细胞/mL的密度将细胞接种于盖玻片上，并在37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育过夜。
7. 处理前，每孔更换为500 µL新鲜完全培养基。用溶剂对照（DMSO或其他用于溶解EIPA的溶剂）或巨胞饮抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利（EIPA，25 µM）预处理巨噬细胞30分钟。
8. 用溶剂对照及巨胞饮刺激剂处理细胞以促进膜皱褶形成：佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA，1 µM，30分钟）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，100 ng/mL，30分钟）。
   注意：也可使用其他抑制剂[如拉盾菌素A（1 µM，30分钟）或细胞松弛素D（1 µM，30分钟）]和刺激剂[如表皮生长因子（EGF，100 ng/mL，10分钟）或血小板源性生长因子（PDGF，100 ng/mL，15分钟）]来表征巨噬细胞及其他细胞类型中的巨胞饮作用。在使用生理刺激剂处理前，细胞可能需要进行过夜血清饥饿处理。需要注意的是，不同细胞类型中有效刺激巨胞饮作用的最佳浓度和孵育时间需另行确定。

2. 扫描电镜固定

1. 处理后，吸去孔板中的培养基，用预冷的 PBS 洗涤盖玻片两次。
2. 在室温下用固定液（0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中含有 4% 多聚甲醛和 2% 戊二醛）固定细胞 30 分钟，随后于 4 °C 在固定液中过夜孵育。
3. 轻柔洗涤并依次加入以下试剂各 500 µL 孵育盖玻片，操作过程中避免破坏细胞单层。
   1. 用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液洗涤一次，孵育 15 分钟。
   2. 用去离子水（dH₂O）洗涤两次，每次洗涤后孵育 10 分钟。
   3. 用 25% 乙醇洗涤两次，每次洗涤后孵育 10 分钟。
   4. 用 50% 乙醇洗涤两次，每次洗涤后孵育 10 分钟。
   5. 用 75% 乙醇洗涤两次，每次洗涤后孵育 10 分钟。
   6. 用 80% 乙醇洗涤两次，每次洗涤后孵育 10 分钟。
   7. 用 95% 乙醇洗涤两次，每次洗涤后孵育 10 分钟。
   8. 用 100% 乙醇洗涤两次，每次洗涤后孵育 10 分钟。
      注意：更换试剂时应迅速操作，以防止细胞干燥。盖玻片可在 4 °C 的 100% 乙醇中保存数天。如需长期保存，应补充额外的 100% 乙醇，并用封口膜覆盖孔板以防止样品干燥。

3. 临界点干燥

1. 将盖玻片放入临界点干燥仪中，并用100%乙醇覆盖。按下 Power 按钮并打开CO₂ 气罐。
2. 按下 Cool 按钮约30秒，直至温度降至0 °C。按下Fill按钮，直到观察窗中出现气泡。
3. 按下 Purge 按钮，直至排气口不再有乙醇气味。再次按下 Cool 按钮，直至温度降至0 °C。
4. 再次按下 Fill 和 Purge 按钮以关闭它们，并关闭CO₂ 气罐。再次按下 Cool 按钮以关闭冷却，然后按下 Heat 按钮。
5. 将温度设定为42 °C，压力设定为1,200 psi。待压力和温度稳定后，按下 Bleed 按钮，使压力缓慢下降。
6. 当腔室压力降至150 psi时，按下 Vent 按钮，并等待压力降至0 psi。关闭临界点干燥仪，并取出盖玻片。
7. 使用 Carbon Adhesive 导电胶带将盖玻片固定在SEM铝制样品台上，并在溅射镀膜仪中使用金/钯进行溅射镀膜处理。
8. 打开 Power 按钮，等待真空度达到30 mTorr。通过关闭气体开关并将 Fine gas 阀门逆时针旋转，冲洗腔室以去除湿气和空气。
9. 当真空度上升至200 mTorr时，关闭气体开关，并等待真空度再次降至30 mTorr。重复此步骤3次。
10. 按下 Timer 按钮，并调节 Voltage 旋钮，使电流表读数为10 mA。从腔室中取出已镀膜的盖玻片。
    注意：请遵循制造商的说明对样品进行临界点干燥和溅射镀膜。

4. 成像与定量分析

1. 将样品盖玻片插入扫描电子显微镜的样品室中。关闭舱门，然后按下 Evac 按钮。
2. 打开扫描电镜操作软件。将加速电压设为 15 kV，工作距离设为 10 mm。
3. 按下 Coordinates 按钮，移动控制器，直至细胞出现在观察屏幕中央。将放大倍数设为 3,500 倍，然后点击拍照按钮对样品成像。
   注意：使用更高倍数（8,500 至 16,000 倍）以更清晰地显示细胞质膜的细节。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	15400-054
2% 戊二醛	Electron Microscopy Sciences	16320
4% 多聚甲醛	Santa Cruz Biotechnology	281692
5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利	Sigma Life Science	A3085
碳胶粘附垫	Electron Microscopy Sciences	77825-09
二甲基亚砜	Corning	25-950-CQC
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24孔透明平底TC处理多孔细胞培养板	Falcon	353047
胎牛血清	Gemini Bio	900-108
HERAcell 150i CO2 培养箱	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 溅射镀膜仪	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR 扫描电子显微镜
显微镜盖玻片	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
佛波醇12-十四烷酰-13-乙酸酯	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 巨噬细胞	ATCC	ATCC TIB-71
重组人M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 临界点干燥仪	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM 铝制样品台	Electron Microscopy Sciences	75220
二甲胂酸钠	Electron Microscopy Sciences	12300
台盼蓝溶液	Thermo Fisher Scientific	15250061