活体荧光显微镜观察微血管血栓形成

摘要

来源：Strüder, D.，等。无毛小鼠耳叶内血栓诱导与活体显微观察。视觉化实验杂志（2017）

本视频展示了利用活体荧光显微技术在小鼠模型中研究血栓形成的方法。通过向小鼠注射荧光标记的多糖以监测血液循环。当耳部微血管受到高强度光照时，光毒性诱导产生损伤，进而导致血栓形成；通过观察血流阻塞现象可确认血栓的生成。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 实验动物的准备

1. 称重小鼠并给予相应药物（例如， 将大麻素（5 mg/kg 体重（bw））注入胰岛素注射器中，并在血栓诱导前 30 分钟给药。
2. 用拇指和食指夹住小鼠的颈部，小指夹住小鼠尾巴，将小鼠拉直，然后将药物注射至腹部左下象限的腹腔内（ip）。将动物放回笼中静置15分钟。
3. 使用氯胺酮（90 mg/kg 体重）和赛拉嗪（25 mg/kg 体重）配制麻醉剂。在血栓诱导前 15 分钟对小鼠进行麻醉。将小鼠放入笼中，轻轻拉出尾巴，使用胰岛素注射器经腹腔注射麻醉剂。
4. 将小鼠放回笼中，直至麻醉开始。为确认麻醉充分，用镊子夹捏小鼠尾巴。
5. 将0.05 mL解冻的异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（FITC-dextran；5%，150 kDa）吸入胰岛素注射器中。填充注射器时，确保无气泡残留，因为即使少量经静脉（iv）注入的气泡也可能对动物造成致命影响。
6. 将麻醉后的小鼠俯卧位放置于加热板上，调节加热板温度至37 °C。
7. 在小鼠角膜上涂抹眼膏。对皮肤进行消毒，并使用无菌器械。
8. 在右耳的头侧和尾侧边缘各缝合一针7/0聚丙烯缝线。缝合位置应尽可能靠近边缘，并尽量靠近耳基部。图1B).
9. 将小鼠移至背侧位置。使用粘性胶带将所有四肢固定在丙烯酸玻璃平台上。将缝合线钩住门齿，并通过粘性胶带将缝合线固定在丙烯酸玻璃上，使头部处于背屈位置。
10. 将动物转移至体视显微镜操作平台下，使用16倍放大倍率。

2. 左颈静脉的准备及FITC-葡聚糖注射

注意：若需对右耳进行显微成像，应准备左侧颈静脉。

1. 使用手术刀在颈部左侧皮肤上沿头尾方向做一个5 mm的切口。用显微镊子和显微剪刀分离皮下组织。对横跨的血管可采用聚酯8/0缝线结扎或电凝止血。
2. 使用显微镊子和显微剪刀剥离静脉周围的外膜，操作过程中避免接触血管本身。
3. 使用已准备好的胰岛素注射器注入荧光染料。用显微镊子小心夹住血管壁，注意不要刺穿静脉。将注射器刺入扩张的血管壁，静脉内注射FITC-葡聚糖（FITC-dextran iv）。
4. 拔出注射器后，使用棉签止血。避免血液和染料污染耳部。

3. 右耳在活体荧光显微镜观察中的定位

1. 将动物转移到加热板上，置于一个带有加热板插槽和一个高0.5 cm用于固定耳朵的平面的丙烯酸玻璃装置中。
2. 使用粘性胶带将动物腹侧朝下固定在加热板上。将耳根部较坚硬且凸起的软骨置于耳朵的0.5 cm高平面旁（图1B），使耳尖部分能够平整地放置在平面上。
3. 在丙烯酸玻璃平面上滴加一滴室温的0.9% NaCl溶液以固定耳朵位置。将右耳置于NaCl液滴上，确保预先缝合的线位于耳凹面的腹侧并朝下。用棉签吸去多余的NaCl溶液，利用毛细作用使耳片紧贴丙烯酸玻璃平面。
4. 用胶带将缝合线固定在丙烯酸玻璃上，以稳定耳朵的位置。
5. 在耳朵凸起的背侧滴加一滴室温0.9% NaCl溶液。小心地将一个盖玻片（直径0.5 cm）放置在耳朵上，避免压迫进入耳朵的基部血管。使用棉签尽可能吸除盖玻片下的NaCl溶液，以最大限度减少盖玻片与目标耳部血管之间的距离。

4. 右耳活体荧光显微成像与血栓诱导

1. 调节活体荧光显微镜以观察FITC-葡聚糖（450 - 490 nm；FT：510；LP：520），使用可变功率的100 W汞灯作为光源。将高分辨率黑白CCD相机连接至DVD录像机。
2. 将动物连同固定其外展耳的丙烯酸玻璃板及加热板一起转移至活体荧光显微镜的载物台上。
3. 使用20倍放大倍数（20X/0.95数值孔径）和20%光照强度，寻找直径为50 - 60 µm、前向血流速度为400 - 600 µm/s的静脉血管。
4. 在盖玻片上滴加一滴室温水，用于63倍放大物镜（63X/0.95数值孔径）的水浸。使用带有直径1 mm套管的注射器，将水滴置于显微镜物镜上，水量应恰好使水滴同时接触盖玻片与物镜。
5. 滴加水滴后立即以20%光照强度开始录像，持续20秒，用于后续离线测量血管直径和血流速度。
6. 在注射FITC-葡聚糖后5分钟开始血栓诱导。此时将光照强度调至100%。
7. 在血栓诱导过程中，每30秒内关闭显微镜光圈2秒以检查血流情况。若血流持续，则重新打开光圈；若血流停止，则继续观察血管30秒。
   注意：若血流静止达30秒或更长时间，或出现逆向血流，则判定该血管为闭塞。若前向血流恢复，应完全打开光圈并继续进行血栓诱导，直至血管如上所述发生闭塞。在早期血栓诱导阶段，应尽可能缩短为检查血流而关闭光圈的时间，以维持几乎连续的落射照明。后期随着血栓生长，血管内灌注的荧光染料减少，可实现连续观察。
8. 每只耳朵选择并使其5根血管发生闭塞。血栓诱导在显微镜下的总时间应限制在注射FITC-葡聚糖后约1小时内完成。

结果

图1. 颈静脉的准备（A）以及耳部在活体显微镜下的定位（B）。（A） 使用手术体视显微镜准备右侧颈静脉。在注射FITC-葡聚糖之前，先缝合用于固定左耳的缝线。先前解剖左侧颈静脉所造成的伤口采用经皮缝合方式闭合 （B）。左耳使用聚丙烯7/0缝线固定。小心放置盖玻片，避免压迫耳部基底血管。实验全程使用加热板维持动物的体温。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SKH-1/hr 小鼠	Charles River	477	可从其他供应商购买
手术体视显微镜	Leica	M651/M655	可从其他供应商购买
活体显微镜	Zeiss	Axiotech Vario 100	可从其他供应商购买
物镜 (20x/0.95)	Zeiss	20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR	可从其他供应商购买
物镜 (63x/0.95)	Zeiss	63x/0,95 W; ACHROPLAN	可从其他供应商购买
黑白CCD相机	Pieper	FK 6990 IQ-S	可从其他供应商购买
DVD录像机	Panasonic	DMR-EX99V	可从其他供应商购买
氯化钠	Braun	5/12612055/1011	可从其他供应商购买
10% 氯胺酮	Bela pharm	F3901-6	可从其他供应商购买
2% 赛拉嗪	Bayer	6293841.00.00	可从其他供应商购买
5% FITC-葡聚糖	Sigma	46945-100MG-F	可从其他供应商购买
5% 泛醇眼膏	Bayer	6029009.00.00	可从其他供应商购买
DMSO	Sigma	472301	可从其他供应商购买
盖玻片 5 × 5 × 1 mm	Menzel	L4339	可从其他供应商购买
胶带	Leukosilk	4683400	可从其他供应商购买
棉签	Sanyo	604-A-1	可从其他供应商购买
红外灯	Beurer	5/13855	可从其他供应商购买
一次性注射器	Braun	2020-08	可从其他供应商购买
胰岛素注射器	Braun	9161502	可从其他供应商购买
一次性皮下注射针头	Braun	465 7640	可从其他供应商购买
端对端毛细管	Sarstedt	19,447	可从其他供应商购买
加热板	Klaus Effenberg	OP-T 185/03	可从其他供应商购买
14.5 cm 剪刀	Aesculap	BC259R	可从其他供应商购买
持针器	Aesculap	BM081R	可从其他供应商购买
显微镊	Aesculap	BD331R	可从其他供应商购买
显微剪	Aesculap	OC496R	可从其他供应商购买
21号手术刀	Dahlhausen	11.000.00.511	可从其他供应商购买
Prolene 7-0	Ethicon	XNEH7470	可从其他供应商购买
电凝器	Servoprax	H40140	可从其他供应商购买
亚克力玻璃垫板			集成加热功能，平面高度0.5 cm