活体荧光显微镜研究微血管血栓形成

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 动物的预先安排

1. 称量小鼠并将相应的药物（例如，大麻素，5 mg/kg 体重 （bw）））装入胰岛素注射器中。在血栓诱导前 30 分钟给药。
2. 用小指将鼠标的脖子放在拇指和食指之间，用小指握住鼠标的尾巴，拉伸动物并将药物腹膜内 （ip） 注射到腹部的左下象限。将动物放回笼子中 15 分钟。
3. 用氯胺酮 （90 mg/kg bw） 和甲苯噻嗪 （25 mg/kg bw） 准备麻醉剂。血栓诱导前 15 分钟，麻醉小鼠。将鼠标放入笼子里，轻轻拉动尾巴，用胰岛素注射器注射麻醉剂 ip。
4. 将鼠标放回笼子中，直到麻醉开始。为了验证麻醉是否充分，请用镊子捏住尾巴。
5. 将 0.05 mL 解冻的荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（FITC-葡聚糖;5%，150 kDa）装入胰岛素注射器中。填充注射器时，确保没有气泡残留，因为即使是静脉注射 （iv） 的小气泡也可能对动物致命。
6. 将麻醉的鼠标正面朝下放在加热板上。将加热板调节至 37 °C。
7. 将眼膏涂在小鼠的角膜上。对皮肤进行消毒并使用无菌器械。
将
8. 两根聚丙烯 7/0 缝合线缝合到右耳的颅骨和尾缘。将缝线尽可能靠近边缘并尽可能靠近底部（图 1B）。
9. 将鼠标移动到背面位置。使用胶条将所有腿固定在亚克力玻璃平台上。将缝合线钩在门牙下方，并通过用胶条将缝合线粘在丙烯酸玻璃上，将头部置于背屈位置。
10. 在作立体显微镜下将动物转移到平台上。使用 16 倍放大倍率。

2. 左颈静脉的制备和 FITC-葡聚糖的注射

注意:对于右耳的显微镜检查，请准备左颈静脉。

1. 使用手术刀，在颈部左侧的皮肤上沿颅尾方向创建一个 5 毫米的切口。用显微镊子和显微剪刀解剖皮下组织。用聚酯 8/0 缝合线或电凝术结扎交叉血管。
2. 使用微型镊子和微型剪刀将静脉从其外膜中释放出来，而无需接触血管。
3. 使用准备好的胰岛素注射器注射荧光染料。用显微镊子小心地抓住血管壁，不要刺穿静脉。用注射器穿透膨胀的血管壁并注射 FITC-葡聚糖静脉注射。
4. 使用棉签取出注射器后止血。避免血液和染料污染耳朵。

3. 活体荧光显微镜检查的右耳定位

1. 将加热板上的动物转移到亚克力玻璃结构上，该结构带有加热板槽和 0.5 厘米高的平面，用于定位耳朵。
2. 使用胶条将动物面朝下固定在加热板上。将相对较强且凸起的软骨放在耳朵底部 0.5 厘米高的耳朵平面旁边（图 1B），以便耳朵的顶端部分可以平放在平面上。
3. 在亚克力玻璃平面上加入一滴室温 0.9% NaCl 以定位耳朵。将右耳放在其凹面腹侧的预先安排的缝合线朝下，滴入 0.9% NaCl 上。使用棉签吸收 NaCl 液滴，让毛细管力将耳平面附着在亚克力玻璃上。
4. 将缝合线粘在亚克力玻璃上以固定耳朵的位置。
5. 在耳朵的凸起背侧加入一滴 0.9% 室温 NaCl。小心地将一个盖玻片（直径 0.5 厘米）放在耳朵上，不要压迫进入耳朵的基底血管。使用棉签从盖玻片下方去除尽可能多的 NaCl，以尽量减少盖玻片与耳目标血管之间的距离。

4. 活体荧光显微镜检查和右耳血栓诱导

1. 调整活体荧光显微镜以进行 FITC-葡聚糖可视化 （450 - 490 nm;FT: 510;LP:520）。使用可变的 100 W 汞灯作为光源。将高分辨率黑白 CCD 摄像机连接到 DVD 刻录机。
2. 将含有加热板的亚克力玻璃上的动物与固定的外展耳转移到活体荧光显微镜的桌子上。
3. 使用 20 倍放大倍率（20 倍/0.95 数字孔径）和 20% 光强度，搜索直径为 50 - 60 μm、顺行血流为 400 - 600 μm/s 的静脉血管。
4. 在盖玻片中加入一滴室温水，以便将 63 倍放大倍率物镜（63 倍/0.95 数字孔径）浸入水中。使用直径为 1 mm 的套管注射器，将液滴滴放在显微镜的物镜上。加入刚好足够的水以接触盖玻片和带有水滴的物镜。
5. 滴水后，立即开始以 20% 的光强度记录容器 20 秒，以便离线测量直径和血流。
6. 注射 FITC-葡聚糖后 5 分钟开始血栓诱导。为此，请将光照强度提高到 100%。
7. 在血栓诱导过程中，在 30 秒内关闭显微镜的孔径 2 秒以检查血流。如果血流持续存在，请再次打开孔。如果血流停止，观察血管 30 s.
   注意: 如果血流静止 30 秒或更长时间或血液逆行流动，则该血管被归类为闭塞。如果直行血流再次开始，请完全打开孔并继续血栓诱导，直到如上所述发生血管闭塞。在早期血栓诱导期间，确保关闭孔径以检查血流的时间尽可能短，以保持几乎连续的落射照明。后来，在血栓生长过程中，用荧光较少的染料灌注血管，因此可以连续观察。
8. 选择并封闭每只耳朵 5 个血管。将显微镜下血栓诱导的时间限制在注射 FITC-葡聚糖后约 1 小时。

图 1.颈静脉的准备 （A） 和用于活体显微镜检查的耳朵的放置 （B）。（A） 使用手术立体显微镜，准备右颈静脉。在注射 FITC-葡聚糖之前缝合用于放置左耳的缝合线。左颈静脉先前解剖的伤口用经皮缝合线 （B） 闭合。左耳用聚丙烯 7/0 缝合线固定。小心放置盖玻片，不要压迫耳朵的基底血管。加热板在整个实验过程中保持动物的体温。