用于分析 DNA 双链断裂的免疫荧光显微镜

摘要

来源:Popp， H. D.， et al.γH2AX 和 53BP1 的免疫荧光显微镜分析，用于分析 DNA 双链断裂的形成和修复。J. Vis. Exp.（2017 年）

在本视频中，我们描述了免疫荧光显微镜技术，用于检测位于人单核细胞中 DNA 双链断裂位点的特定 DNA 损伤反应蛋白。这些蛋白质被特异性一抗识别，而特异性一抗又与荧光团标记的二抗结合，这些二抗在显微镜下可视化时发出荧光，从而能够将蛋白质可视化为细胞核内不同的荧光灶。

方案

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利指南执行，并已由当地机构审查委员会审查。

1. 细胞离心涂片的制备

1. 通过离心（300 x g ，10 分钟）1.0 x 10⁵ 个细胞，用患者样品的单核细胞制备两个细胞离心涂片（即，一个用于γH 2 AX免疫荧光染色的细胞离心涂片和一个用于γH 2 AX和53BP1联合免疫荧光染色的细胞离心涂片（图1和2）（图1和2）。

2. γH2AX 和 53BP1 免疫荧光染色

1. 固定和透化:用 200 μL 4% PFA 固定细胞 10 分钟。固定后，在实验室摇床上用 30 mL PBS 轻轻洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。然后用 200 μL 的 0.1% Octoxinol 9 透化细胞 10 分钟。在实验室摇床上用 30 mL 的 5% 封闭溶液轻轻洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。将细胞在 30 mL 新鲜的 5% 封闭溶液中封闭 1 小时。
2. 与抗体孵育
   1. 将一种细胞制剂与小鼠单克隆抗γH2AX抗体（1:500）和另一种细胞制剂与小鼠单克隆抗γH2AX抗体（1:500）和多克隆兔抗53BP1抗体（1:500）在4°C下孵育过夜。
   2. 孵育后，在实验室摇床上用 30 mL 的 2% 封闭液轻轻洗涤细胞 3 次，每 5 分钟一次。
   3. 去除封闭溶液，将细胞的第一次制备与 Alexa488 偶联的山羊抗小鼠二抗 （1:500） 和细胞的第二次制备与 Alexa488 偶联的山羊抗小鼠二抗 （1:500） 和 Alexa555 偶联的驴抗兔二抗 （1:500） 在室温下孵育 1 小时。
3. 封固剂:将载玻片和细胞放入碗中，在实验室摇床上用 30 mL PBS 轻轻洗涤细胞 3 次，每 5 分钟一次。去除 PBS 并用含有 4,6-二脒基-2-苯基吲哚的封固剂封固细胞。小心地将盖玻片放在封固剂的顶部，以免嵌入气泡。等待至少 3 小时让封固剂硬化，然后再通过荧光显微镜分析细胞。

3. γH2AX 和 53BP1 病灶分析

1. 荧光显微镜:在成像过程中，用配备有 DAPI、Alexa 488 和 Cy3 滤光片的荧光显微镜以 100 倍物镜放大分析细胞核中的 γH2AX 和 53BP1 病灶。使用相机记录图像，并使用适当的成像软件处理图像。

结果

图 1:用于制备细胞离心涂片的装置。

图 2:细胞离心涂片的制备。通过以 300 x g 离心 1.0 x 10⁵ 个细胞 10 分钟来制备每个样品的两个细胞离心涂片。一种细胞离心涂片用于 γH2AX 免疫荧光染色，另一种细胞离心涂片用于 γH2AX 和 53BP1 免疫荧光联合染色。

材料