来源：Popp, H. D.，等。利用γH2AX和53BP1的免疫荧光显微镜分析DNA双链断裂的形成与修复。J. Vis. Exp. (2017)
在本视频中，我们介绍了免疫荧光显微技术，用于检测定位于人单个核细胞DNA双链断裂位点的特定DNA损伤应答蛋白。这些蛋白可被特异性的一抗识别，一抗进而结合带有荧光染料标记的二抗；在显微镜观察时，二抗发出荧光，从而使得细胞核内这些蛋白呈现为清晰可辨的荧光焦点，实现可视化观察。
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方法文章
用于分析DNA双链断裂的免疫荧光显微镜技术
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际关于人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。
1. 细胞离心涂片的制备
- 通过离心（300 × g，10 分钟）每份制备 1.0 × 105 个细胞，制备两份患者样本的单个核细胞涂片（即，一份用于 γH2AX 免疫荧光染色，另一份用于 γH2AX 与 53BP1 联合免疫荧光染色）（图 1 和 2）。
2. γH2AX 和 53BP1 免疫荧光染色
- 固定与通透：使用 200 µL 的 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞 10 分钟。固定后，在摇床上用 30 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。随后使用 200 µL 的 0.1% Octoxinol 9 通透细胞 10 分钟。再次在摇床上用 30 mL 的 5% 封闭液轻柔洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。最后将细胞置于 30 mL 新鲜的 5% 封闭液中封闭 1 小时。
- 抗体孵育
- 将一组细胞与小鼠单克隆抗-γH2AX 抗体（1:500）孵育，另一组细胞与小鼠单克隆抗-γH2AX 抗体（1:500）及兔多克隆抗-53BP1 抗体（1:500）共同孵育，4 °C 过夜。
- 孵育结束后，在摇床上用 30 mL 的 2% 封闭液轻柔洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
- 吸除封闭液后，将第一组细胞与 Alexa488 标记的山羊抗小鼠二抗（1:500）孵育，第二组细胞与 Alexa488 标记的山羊抗小鼠二抗（1:500）及 Alexa555 标记的驴抗兔二抗（1:500）共同孵育，室温孵育 1 小时。
- 封片：将载有细胞的玻片放入容器中，在摇床上用 30 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤 3 次，每次 5 分钟。吸除 PBS 后，使用含 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂封片。小心地将盖玻片覆盖在封片剂上，避免产生气泡。封片剂需至少静置 3 小时以完全固化，之后方可进行荧光显微镜观察。
3. γH2AX 和 53BP1 焦点的分析
- 荧光显微镜检查：使用配备DAPI、Alexa 488和Cy3滤光片的荧光显微镜，在100倍物镜放大倍数下观察细胞核中的γH2AX和53BP1焦点。用相机记录图像，并使用适当的成像软件处理图像。
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结果
图1：用于制备细胞离心涂片的装置。
图 2： 细胞离心涂片的制备。每个样本制备两张细胞离心涂片，通过将 1.0 × 105 个细胞在 300 × g 条件下离心 10 分钟获得。其中一张涂片用于 γH2AX 免疫荧光染色，另一张涂片用于联合 γH2AX 和 53BP1 免疫荧光染色。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 诊断用显微镜载玻片 | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | 显微镜载玻片 |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | 台式离心机 |
| 细胞离心涂片装置 | |||
| 盖子 | Heraeus | 76003422 | 用于不使用微量管时的盖子 |
| 细胞容器 | Heraeus | 75003416 | 带两个锥形孔的细胞容器 |
| 夹具载架 | Heraeus | 75003414 | 用于固定细胞容器和载玻片的载架 |
| 支撑插件 | Heraeus | 75003417 | 用于固定夹具载架的支撑插件 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | 固定剂 |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | D8537 | 平衡盐溶液 |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | 封闭剂 |
| 小鼠单克隆抗-γH2AX 抗体 (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | 用于检测 γH2AX 的一抗 |
| 兔多克隆抗-53BP1 抗体 (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | 用于检测 53BP1 的一抗 |
| Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠抗体 | Invitrogen | A-11001 | 二抗 |
| Alexa Fluor 555 标记的驴抗兔抗体 | Invitrogen | A-31572 | 二抗 |
| Vectashield 封片介质 | Vector Laboratories | H-1200 | 含 DAPI，用于 DNA 染色 |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | 荧光显微镜 |
| Cool Cube 1 CCD 相机 | Metasystems | H-0310-010-MS | 用于数字记录的相机系统 |
| Isis 软件 | Metasystems | Not applicable | 显微镜软件 |
