利用核磁共振波谱法鉴定蛋白质中的多位点磷酸化

摘要

来源：Danis, C. 等.，利用核磁共振波谱法鉴定内在无序蛋白的多重磷酸化位点。视觉化实验杂志（2016年）。

本视频演示了利用核磁共振波谱法（NMR）技术鉴定蛋白质中多个磷酸化位点的方法。蛋白质在特定氨基酸位点发生磷酸化会导致邻近酰胺氢的去屏蔽效应，从而产生谱图差异。

方案

1. ¹⁵N、¹³C标记Tau蛋白的制备（图1）

1. 将pET15b-Tau重组T7表达质粒转化至BL21(DE3)感受态大肠杆菌（Escherichia coli）细胞中。
   注意： 编码最长Tau亚型（441个氨基酸残基）的cDNA已克隆至pET15b质粒的NcoI和XhoI限制性酶切位点之间。
   1. 在1.5 ml塑料离心管中，轻轻混合50 µl感受态BL21(DE3)细胞（每µg质粒DNA可形成1-5 × 10⁷个菌落）与100 ng质粒DNA。
      注意： 表达真核cDNA时，无需使用密码子优化的细菌菌株即可有效表达人源Tau蛋白。
   2. 将细胞混合物置于冰上30分钟，随后在42 °C热激10秒。再将离心管放回冰上5分钟，加入1 ml室温LB（Luria-Bertani）培养基。将菌液在37 °C下轻度振荡培养30分钟。
2. 用接种环取100 µl菌液，均匀涂布于含100 µg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。
3. 将筛选平板在37 °C下培养15小时。
4. 培养结束后将筛选平板保存于4 °C，直至进入培养步骤，最长可保存约2周。
   注意： 可制备细菌甘油冻存液（含50%甘油），于-80 °C保存，以便后续直接用于接种培养。
5. 向1 L已高压灭菌的M9盐溶液（含6 g Na₂HPO₄、3 g KH₂PO₄、0.5 g NaCl）中加入1 ml 1 M MgSO₄、1 ml 100 mM CaCl₂、10 ml 100倍MEM维生素补充液、1 ml 100 mg/ml氨苄青霉素。
   注意： 加入CaCl₂溶液后，M9盐溶液中会短暂出现白色沉淀，随后迅速溶解。
6. 将300 mg ¹⁵N, ¹³C完全培养基、1 g ¹⁵NH₄Cl和2 g ¹³C₆-葡萄糖溶于10 ml M9培养基中。使用0.2 µm滤器将同位素溶液过滤除菌，直接加入M9培养基中。
7. 用接种环从筛选平板上挑取一单菌落，接种至20 ml含100 µg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，充分悬浮。
8. 将接种后的培养基在37 °C下培养约6小时。
9. 取1 ml经10倍稀释的菌液，使用塑料比色皿在600 nm处测定光密度（OD₆₀₀）。
   注意： 当菌液浊度对应的OD₆₀₀值达到3.0–4.0时，表明细菌已进入饱和生长期。
10. 将20 ml饱和LB菌液接种至1 L含氨苄青霉素（终浓度100 µg/ml）的M9培养基中，置于2 L带挡板的锥形塑料培养瓶中。
11. 将培养瓶放入程序控温摇床中，初始设置为10 °C、50 rpm。设定摇床于次日清晨自动切换至200 rpm、37 °C。
12. 取1 ml菌液，使用塑料比色皿测定OD₆₀₀。当OD₆₀₀达到约1.0时，加入400 µl 1 M IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）储存液（-20 °C保存），以诱导重组Tau蛋白的表达。
13. 继续在37 °C下培养3小时。随后在5,000 × g离心20分钟，收集菌体。
14. 将菌体沉淀于-20 °C冷冻保存。如需可长期冻存，直至进行蛋白纯化步骤。

2. ¹⁵N, ¹³C标记Tau蛋白的纯化（图2）

1. 将阳离子交换（CEX）纯化缓冲液在15 psi压力下、121 °C条件下高压灭菌20分钟。将缓冲液储存于4 °C。
2. 解冻细菌细胞沉淀，并用45 ml提取用CEX A缓冲液（50 mM NaPi缓冲液，pH 6.5，含1 mM EDTA）充分重悬，该缓冲液需新鲜添加1×蛋白酶抑制剂混合物（1片）和DNAseI（2,000单位）。
3. 使用高压均质机在20,000 psi条件下裂解细菌细胞，需进行3–4次循环。在20,000 × g条件下离心40分钟，以去除不溶性物质。
4. 将细菌细胞提取物置于水浴中，在75 °C加热15分钟。
   注意：数分钟后可观察到白色沉淀产生。
5. 在15,000 × g条件下离心20分钟，保留含有热稳定Tau蛋白的上清液。
6. 如需保存，可将样品储存在-20 °C，直至进行下一步纯化。
7. 使用强阳离子交换树脂装填5 ml柱床，并在快速蛋白液相色谱（FPLC）系统上进行阳离子交换层析（图3 A）。
   1. 设定流速为2.5 ml/min。
   2. 用CEX A缓冲液平衡层析柱。
   3. 通过样品泵或系统中的泵A（视具体系统而定）将60–70 ml加热后的含Tau提取物上样。收集穿流液用于分析，以确认Tau蛋白是否有效结合至树脂（见步骤2.8）。
   4. 用CEX A缓冲液洗涤树脂，直至280 nm处吸光度恢复至基线水平。
   5. 通过逐步增加CEX B缓冲液（含1 M NaCl的CEX A缓冲液）实现三步NaCl梯度洗脱Tau蛋白。FPLC程序设置如下：第一步在10个柱体积（CV）内梯度升至25% CEX B缓冲液，达到250 mM NaCl；第二步在5 CV内升至50% CEX B缓冲液，达到500 mM NaCl；第三步在2 CV内升至100% CEX B缓冲液，达到1 M NaCl。在洗脱过程中收集每管1.5 ml的组分。
8. 取洗脱过程中收集的各组分10 µl，进行SDS-PAGE分析（12% SDS-丙烯酰胺凝胶）并用考马斯亮蓝染色（图3 A）。同时取10 µl穿流液进行分析，以检测上样步骤中Tau蛋白的结合情况。
9. 选择含有Tau蛋白的组分，并将其合并用于下一步操作。
10. 对含Tau蛋白的合并组分进行缓冲液置换（图3 B）。
    1. 使用FPLC系统，以50 mM碳酸氢铵（挥发性缓冲液）平衡装有53 ml G25树脂（26 × 10 cm）的脱盐柱。
    2. 设定流速为5 ml/min。通过5 ml进样环将Tau样品注入层析柱，收集280 nm处吸收峰对应的组分。
    3. 根据初始CEX合并液的体积，重复进样3–4次。
11. 根据280 nm处色谱图的峰面积计算纯化Tau蛋白的含量（1 mg Tau对应140 mAU*ml）。
    注意：Tau蛋白在280 nm处的消光系数为7,550 M^-1cm^-1。Tau蛋白不含任何色氨酸（Trp）残基。
12. 将所有含Tau蛋白的组分合并。
13. 将样品分装至若干离心管中，每管含1至5 mg Tau蛋白。选择管体容积远大于溶液体积的离心管（例如，5 ml溶液置于50 ml离心管中）。
14. 用针头在管盖上打孔。将Tau样品在-80 °C冷冻。
15. 对Tau样品进行冻干。冻干后的Tau蛋白可在-20 °C长期保存。

3. ¹⁵N-Tau 的体外磷酸化

1. 将5 mg冻干Tau蛋白溶解于500 µl磷酸化缓冲液（50 mM Hepes·KOH，pH 8.0，12.5 mM MgCl₂，1 mM EDTA，50 mM NaCl）中。
2. 在总体积为1 ml的样品中加入2.5 mM ATP（25 µl 100 mM储存液，-20 °C保存）、1 mM DTT（1 µl 1 M储存液，-20 °C保存）、1 mM EGTA（2 µl 0.5 M储存液）、1×蛋白酶抑制剂混合物（25 µl 40×储存液，通过将1片试剂溶于1 ml磷酸化缓冲液制备）以及1 µM活化的His-ERK2（250 µl保存于-80 °C的保存缓冲液中，缓冲液成分为10 mM Hepes，pH 7.3，1 mM DTT，5 mM MgCl₂，100 mM NaCl和10%甘油）。
   注意：活化的His-ERK2可通过MEK激酶磷酸化在实验室自行制备。
3. 在37 °C孵育3小时。
4. 将样品在75 °C加热15分钟以灭活ERK激酶。
5. 在20,000 × g离心15分钟，收集并保留上清液。
6. 使用装有3.45 ml G25树脂（柱尺寸1.3 × 2.6 cm）的脱盐柱，将蛋白样品置换至50 mM碳酸氢铵溶液中，适用于1 ml样品。
7. 取2.5 µl蛋白样品进行12% SDS-PAGE电泳，以检测蛋白完整性和磷酸化效率（图4）。
8. 将磷酸化的Tau蛋白样品冻干，粉末于-20 °C保存。

4. 核磁共振谱图的采集（图5）

1. 将4 mg冻干的¹⁵N、¹³C标记的ERK磷酸化Tau溶于400 µl NMR缓冲液中（50 mM NaPi或50 mM氘代Tris-d11.Cl，pH 6.5，30 mM NaCl，2.5 mM EDTA，以及1 mM DTT）。
2. 加入5% D₂O用于NMR谱仪的磁场锁场，并加入1 mM TMSP（3-(三甲基硅基)丙酸-2,2,3,3-d₄钠盐）作为NMR信号内标。再加入10 µl 40倍浓度的蛋白酶抑制剂混合物原液。
3. 使用带长针头的电子移液器或巴斯德吸管将样品转移至5 mm NMR样品管中。用推杆封闭NMR管，通过移动推杆排除推杆与液体之间夹带的气泡。
4. 将NMR样品管放入样品转子中。使用与所用NMR探头匹配的量规调整样品管在转子中的垂直位置，使样品溶液的大部分位于NMR线圈内部。
5. 启动气流：在磁体控制系统窗口中点击lift。小心地将装有样品管的转子置于磁体孔道顶部的气流中。停止气流（点击lift），使样品管下降并准确落入探头内。
6. 将温度设定为25 °C（298 K）。
7. 执行探头的半自动调谐与匹配，以优化射频功率传输效率。在命令行中输入atmm。
8. 利用样品在氘通道中测得的D₂O信号锁定谱仪频率。在磁体控制系统窗口中点击lock。
9. 启动匀场程序，以优化样品位置处磁场的均匀性。在命令行中输入topshim gui以打开匀场窗口，点击匀场窗口中的Start。检查残余B0标准偏差值以确认匀场效果是否最佳（小于2 Hz为良好）。
10. 校准p1参数（质子射频脉冲的持续时间，单位为µsec），该参数用于实现质子自旋的90°翻转。通过水的质子1D谱（图6）中的360°脉冲进行校准。
11. 通过设置o1参数（单位为Hz）至1D谱中水的质子频率，调整频率偏移（图6）。
12. 开始采集1D质子谱（使用水抑制脉冲序列，例如zggpw5），以验证样品信号（图7）。根据蛋白质的相对浓度调整扫描次数。在命令行中输入zg以启动采集。

结果

图1：重组蛋白表达与同位素标记主要步骤示意图。从细菌转化到重组蛋白表达的各步骤如方案第1段所述。

图 2：重组 Tau 蛋白纯化主要步骤示意图。从细菌细胞裂解到重组蛋白纯化的各步骤，如方案第 2 段所述。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pET15B 重组 T7 表达质粒	Novagen	69257	保存于 -20°C
BL21(DE3) 感受态 E.coli 菌株	New England Biolabs	C2527I	-80 保存°C
高压灭菌的LB肉汤，Lennox	DIFCO	240210	细菌培养基
MEM维生素混合液（100倍浓缩）	Sigma	58970C	细菌培养基添加剂
<sup>15</sup>N, <sup>13</sup>C-ISOGRO 完全培养基粉末	Sigma	608297	细菌培养基添加剂
<sup>15</sup>NH4Cl	Sigma	299251	同位素
<sup>13</sup>C-葡萄糖	Sigma	389374	同位素，4℃保存&#176;C
蛋白酶抑制剂片剂	罗氏	5056489001	1片溶于1 ml即为40X溶液，可保存于-20℃&#176;C
DNaseI	EUROMEDEX	1307	-20℃保存&#176;C
匀浆器（EmulsiFlex-C3）	AVESTIN		裂解在4℃下进行&#176;C
皮尔斯<sup>TM</sup> 未染色蛋白质分子量标准品	皮尔斯	266109
活性人源MEK1激酶，GST标签	Sigma	M8822	-80 保存&#176;C
AKT&#196; 纯化色谱系统	GE Healthcare		FPLC
HiTrap SP Sepharose FF（5 mL 柱）	GE Healthcare	17-5156-01	阳离子交换层析柱
HiPrep 26/10 脱盐柱	GE Healthcare	17-5087-01	蛋白质脱盐柱
PD MidiTrap G-25	GE Healthcare	28-9180-08	蛋白质脱盐柱
Tris D11，97% D	Cortecnet	CD4035P5	氘代核磁共振缓冲液
5 mm 对称微管 SHIGEMI D<sub>2</sub>O（5个内环套装） &#38; 外管	Euriso-top	BMS-005B	NMR Shigemi 管
eVol 套件—电子注射器入门套件	Cortecnet	2910000	移液
Bruker 900 MHz AvanceIII，配备三共振低温探头	Bruker		用于数据采集的核磁共振波谱仪
布鲁克600兆赫兹DMX600，配备三共振低温探头	Bruker		用于数据采集的核磁共振波谱仪