研究DNA-蛋白质相互作用的圆二色光谱技术

摘要

来源：Arya, V.，等。利用圆二色光谱研究DNA-蛋白质相互作用。视觉化实验杂志（2022年）。

本视频演示了利用圆二色光谱（CD）技术研究ATP依赖性染色质重塑蛋白存在时DNA发生的构象变化。在有无ATP水解条件下测得的CD光谱变化表明，ATP对于重塑蛋白诱导结合DNA发生构象改变的能力具有重要作用。

1. 反应组分的工作浓度

新鲜配制圆二色光谱（CD）实验所需缓冲液的工作浓度溶液，并在进行反应前置于 4 °C 保存。
注意： 本文所述 CD 反应中各组分的工作浓度如下：磷酸钠缓冲液（pH 7.0）1 mM，ATP 2 mM，DNA 500 nM，蛋白质 1 µM，MgCl₂ 10 mM，EDTA 50 mM，ADAADiN 5 µM。

2. 圆二色性比色皿的选择与准备

在高透明度石英比色皿中采集圆二色光谱。可使用矩形或圆柱形比色皿。
注意：本论文中描述的所有反应均使用一种石英圆二色比色皿（标称体积为 0.4 mL，光程为 1 mm）。
使用比色皿清洗液清洗比色皿。将1%的比色皿清洗液溶于水中，配制成400 µL溶液，加入比色皿中，并在37 °C下孵育1小时。
用清水多次冲洗比色皿以彻底清洁。在比色皿中装入水或缓冲液进行扫描，检查其是否清洁。
注意：水或缓冲液的读数必须在0至1 mdeg范围内。

3. 蛋白质和DNA寡核苷酸的制备

在反应中保持蛋白质体积低于 50 µL，以尽量减少缓冲液组分的用量，这些组分有时会导致出现不明确的峰。整个实验过程中应将蛋白质置于冰上，以避免任何降解。
在反应中使用经过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化的DNA寡核苷酸。
注意： 在此处描述的反应中，DNA既以天然形式使用，也以加热后冷却的形式使用（快速冷却（FC）和缓慢冷却（SC））。快速冷却促进DNA分子内的键合，产生更多的二级结构；而缓慢冷却则促进DNA分子间的键合，导致较少的二级结构形成。
对于快速冷却，将DNA在加热块上于94 °C加热3分钟，然后立即置于冰上冷却。对于缓慢冷却，将DNA在94 °C加热3分钟后，使其以每分钟1 °C的速率冷却至室温。

4. 设置对照实验以记录基线光谱

所有反应体系的体积均保持为 300 µL。依次在 1.5 mL 离心管中设置共 5 个基线反应：i) 缓冲液 + 水；ii) 缓冲液 + MgCl₂ + ATP + 水；iii) 缓冲液 + MgCl₂ + ATP + 蛋白质 + 水；iv) iii + EDTA 或 ADAADiN；v) 缓冲液 + 蛋白质 + 水。

5. 设置实验以记录圆二色光谱

在1.5 mL离心管中依次设置共5个反应，具体如下：i) 缓冲液 + DNA + 水；ii) 缓冲液 + DNA + MgCl₂ + ATP + 水；iii) 缓冲液 + DNA + MgCl₂ + ATP + 蛋白质 + 水；iv) iii + EDTA 或 ADAADiN；v) 缓冲液 + DNA + 蛋白质 + 水。

6. 记录扫描

打开气体并启动圆二色光谱仪。
等待 10–15 分钟后打开光源。启动水浴，并将样品池温度设定为 37 °C。
打开 CD spectrum 软件。
1. 将温度设置为37 °C。
2. 将波长范围设置为180 – 300 nm。
3. 将每数据点采集时间设置为0.5 s。
4. 将扫描次数设置为5。
5. 点击Pro-Data Viewer，新建一个文件，并根据实验内容和日期重命名。
将所有反应组分置于冰上，以避免任何降解。在离心管中依次配制基线样品和反应体系，并通过移液混匀。小心地将反应混合物转移至比色皿中，确保无气泡产生。
若进行时间进程实验，将反应体系在 37 °C 下孵育所需时间后进行扫描。向含有 DNA、ATP、Mg⁺² 和蛋白的缓冲液中加入 EDTA，以终止 ATP 水解反应。
提高 EDTA 的浓度及其孵育时间，以完全抑制 ATP 酶活性。
在软件中将相应反应的基线扣除（例如，从反应 1 中扣除基线 1）。可在 CD spectrum 软件或数据绘图软件中对数据进行平滑处理，并使用数据绘图软件绘制图表。
注意：从相应反应中扣除基线后，可获得仅来自 DNA 的净圆二色光谱。

7. 数据分析与解释

使用公式（1）将毫度单位的测量值转换为平均残基椭圆性。

其中，S 为以毫度表示的圆二色（CD）信号，c 为 DNA 浓度（单位：mg/mL），mRw 为平均残基质量，l 为光程（单位：cm）。
利用数据绘图软件，以波长为横坐标、平均残基椭圆性为纵坐标绘制曲线图，并分析其峰形特征。
绘图时，将平均残基椭圆性设为 Y 轴变量，波长设为 X 轴变量，绘制折线图。
注意：该图谱可显示不同构象 DNA 的特征吸收峰，结合已有文献可鉴定各峰所对应的 DNA 构型。

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