一种基于拉曼光谱的直接免疫测定法检测特定抗原

摘要

来源：Hanson, C.，等。构建紫外-可见光与拉曼光谱免疫分析平台。J. Vis. Exp.(2016)。

在本视频中，我们介绍了一种基于拉曼光谱的直接免疫分析方法，用于检测特定的目标抗原。附着在拉曼探针表面的金纳米颗粒上的抗体可与目标抗原发生相互作用，产生特定的拉曼光谱，随后被检测到。

方案

1. 准备紫外-可见/拉曼探针

1. 制备裸金纳米颗粒溶液
   1. 制备2 ml浓度约为1 × 10¹¹ 粒子/ml的AuNPs溶液。
      1. 如果需要浓缩 AuNPs，将 2,000 μl 的 AuNP 储液加入低吸附离心管中，在 5,000 x g 孵育20分钟，或直至上清液澄清。用移液器小心移除上清液，注意不要扰动金纳米颗粒（AuNP）沉淀。
      2. 将剩余的AuNP溶液合并至一个离心管中，通过紫外-可见光谱测量并对照已知浓度的标准曲线来估算其浓度，因为该关系呈线性。
2. 确定合适的拉曼报告分子标记比例
   1. 配制溶于甲醇的拉曼报告分子工作溶液。该浓度取决于所使用的报告分子。本研究中，配制浓度为 200 μM 的 3,3′-二乙基硫三碳菁碘化物（DTTC）工作溶液。
   2. 假设每个孔的终体积为 100 μl，向 96 孔板第一行的每个孔中加入足量的工作用报告分子溶液，使拉曼报告分子的浓度范围为 0.2 μM 至 10 μM。向每个孔中加入适量的 HPLC 级水，使液体体积达到 80 μl。然后向每个孔中加入 20 μl 的 AuNP，使每个孔的终体积为 100 μl。示例见于 表1.
   3. 使用酶标仪型紫外-可见分光光度计测量400至700 nm范围内的紫外-可见吸收光谱。合适的浓度是指在紫外-可见光谱中具有清晰峰形的最高浓度。逐步提高浓度，重复步骤2.2.2，直至确定拉曼报告分子与金纳米颗粒（AuNPs）的最高浓度比。
      注意： 染料以及金纳米颗粒（AuNP）的形状、大小和生产商均会影响其合适浓度。因此，必须根据所用的具体组分对本方案中列出的步骤进行评估和调整。本实验采用了带正电荷的染料，因此使用带负电荷的AuNP可增强AuNP与报告分子之间的结合，本实验通过采用柠檬酸盐包被的AuNP实现负电荷修饰。更多细节请参见讨论部分。
3. 将拉曼报告分子和 PEG-Ab 结合至 AuNP
   1. 制备两份1.5 ml的AuNP和拉曼报告分子溶液，浓度为先前确定的浓度，于室温下孵育30分钟，使拉曼报告分子结合到AuNP上。
   2. 将聚乙二醇化抗体（PEG-Ab）加入一组 AuNP 和拉曼报告分子溶液中，使抗体与颗粒的比例为 200:1，该溶液用于检测样本。在另一个微量离心管中，将聚乙二醇化抗原加入另一组 AuNP 和拉曼报告分子溶液中，抗体与颗粒的比例同样为 200:1，作为对照使用。室温下孵育 30 分钟。
      注意：抗体与颗粒的比例取决于所使用的金纳米颗粒（AuNPs）和染料，应针对每种具体情况分别优化。此处的目标是在防止颗粒聚集的前提下，使AuNP探针结合尽可能高比例的抗体。使用以下公式确定应混合的适当体积：
      
      其中 V 是体积，和 C 浓度以每毫升的颗粒数或抗体数表示。最终体积应约为1.5 ml。
4. 用 mPEG-SH 封闭 AuNP 表面的剩余位点。
   1. 将固态甲氧基聚乙二醇硫醇（mPEG-SH）溶于水，配制成200 μM浓度的溶液。涡旋振荡溶液，直至mPEG-SH完全溶解。
   2. 将mPEG-SH以40,000:1的比例加入2.3步制备的AuNP-PEG-Ab溶液中。室温孵育10分钟，以确保金纳米颗粒上的剩余位点被封闭。使用以下公式确定应添加的各组分体积：
      
      其中 V 是体积，和 C 浓度以每毫升的颗粒数或抗体数表示。最终体积应约为1.5 ml。
5. 回收功能化拉曼探针。
   1. 在 5,000 x 离心颗粒 g 在低吸附离心管中离心20分钟，或直至上清液澄清。用移液器小心移除上清液，注意不要扰动金纳米颗粒（AuNPs）。
   2. 用先前配制的1 ml 1×PBS溶液重悬颗粒。取少量溶液（3 μl）进行紫外-可见光谱测定，通过与已知浓度的AuNP测量结果比较，估算AuNP浓度。调整溶液体积，使最终浓度至少为1 × 10¹¹ 每毫升颗粒数
   3. 将溶液储存于 4 °C，直至用于免疫测定板的功能化。溶液需在一周内使用。

表1. DTTC稀释示例。 DTTC的不同稀释度及其对应的DTTC储备液、金纳米颗粒溶液和水的体积。

	各组分需添加的体积（ml）
DTTC 终浓度（mM）	DTTC 工作液（200 mM）	AuNP	水
0.2	0.1	20	79.9
0.6	0.3	20	79.7
1	0.5	20	79.5
2	1.0	20	79
5	2.5	20	77.5
7	3.5	20	76.5
10	5.0	20	75

2. 免疫测定板的准备

1. 将目标抗原结合到免疫测定板上。
   1. 准备足量的稀释抗原（50 μg/ml）以填充聚苯乙烯微孔板的孔。将溶液涡旋混匀后，立即加入到板孔中。室温孵育1小时，使抗原与板结合。
2. 洗去未结合的抗原。
   1. 将多余的抗原溶液倒入废弃容器中，并将板轻轻敲击在铺有纸巾的桌面上以去除残留液体。
   2. 向孔中加入 TBST 洗涤表面，然后以之前所述相同方式移除洗涤液。重复此步骤两次。
3. 封闭板上剩余的结合位点，以防止非特异性结合。
   1. 向每孔中加入70 μl HSA封闭液，在室温下孵育30 min。
   2. 按照步骤3.2中所述相同程序移除并冲洗平板。盖好平板，于4 °C干燥保存，直至准备进一步使用。
4. 功能化免疫测定板。
   1. 将第2节中制备的探针纳米颗粒70 μl加入96孔板的第一列，并使用1:2倍比稀释法对后续各列进行稀释。将该板孵育至少1小时。免疫分析板的制备示例如下所示： 图1.
   2. 用 TBST 按照步骤 3.2 中所述方法洗涤平板 5 次，注意妥善处理金纳米颗粒（AuNPs）。最后一次洗涤后，向每孔加入 70 μl 的 1x PBS，并用封板膜密封。
      注意对照样品应为无色透明。如果发生非特异性结合，对照样品将呈现与检测样品相似的颜色。
5. 通过紫外-可见光谱和拉曼光谱测试分析物的灵敏度。
   1. 使用酶标仪型紫外-可见分光光度计，对每个孔测定400至700 nm范围内的紫外-可见吸收光谱。
   2. 使用倒置拉曼显微镜，将物镜聚焦于含有金纳米粒子探针（AuNP probes）的孔板表面，获取该孔的拉曼光谱，采集范围为1,800 cm⁻¹至200 cm⁻¹的光谱。^-1 至 400 cm^-1对所有孔重复此步骤。
   3. 使用适当的光谱软件，执行 11^th-order 多项式基线校正用于拉曼光谱及 3^rd紫外-可见光谱的-order多项式。
   4. 使用适当的光谱软件对拉曼光谱和紫外-可见光谱进行归一化处理。将最大值设为1，并相应地缩放所有其他数值。对于拉曼光谱的归一化，选择一个独特的聚苯乙烯峰并将其设为1，然后相应地缩放所有其他数值。
   5. 使用适当的光谱软件对每条光谱进行峰面积积分。对于拉曼光谱，代表拉曼报告分子的峰必须位于无聚苯乙烯峰的区域。进行峰积分时，需为待测峰设定积分边界，并记录所有样品（包括对照组）中该峰的面积。
   6. 以金纳米颗粒（AuNP）浓度的对数值为横坐标，以目标平均峰面积为纵坐标，绘制每个数据点及其对应标准差作为误差线的散点图。将这些校准点拟合为四参数逻辑斯蒂曲线。
   7. 通过计算空白样品中目标峰面积的平均值来确定空白值的均值。计算这些峰面积的标准差，此即为空白值的标准差。
   8. 针对上一步中分析的同一峰，求其最低浓度下峰面积的标准偏差。
   9. 根据代表性结果部分所述，计算空白限和检测下限。将这些值与四参数逻辑曲线（4PL）校准曲线结合，以确定金纳米颗粒（AuNP）浓度对应的定量下限（LLOD）。

结果

图1. 制备好的免疫测定板。 制备好的免疫测定板图像。A至E行为测试样品，F至H行为对照样品。第1列为未稀释的纳米颗粒，后续每列AuNP探针的浓度减半。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
60 nm 金纳米颗粒	Ted Pella, Inc.	15708-6	这些是柠檬酸盐包被的金纳米颗粒。有关拉曼探针分子与金纳米颗粒表面电荷之间的关系及其在正确选择金纳米颗粒和/或拉曼探针分子中的重要性，请参见讨论部分。
碳酸氢钠	Fisher Scientific	S233-500
甲醇	Pharmco-Aaper	339000000
Tris缓冲盐水（10倍浓缩液），pH 7.5	Scy Tek	TBD999
瓶顶过滤装置	VWR	97066-202
Tween 20（聚山梨酯20）	Scy Tek	TWN500	用作洗涤步骤中的乳化剂。
磷酸盐缓冲液（10倍浓缩液），pH 7.4	Scy Tek	PBD999
蛋白低吸附管，2.0 ml	Eppendorf Tubes	22431102	低吸附管可防止蛋白质和金纳米颗粒结合到管壁表面。
蛋白低吸附管，0.5 ml	Eppendorf Tubes	22431064	低吸附管可防止蛋白质和金纳米颗粒结合到管壁表面。
微孔板密封膜 UniSeal	GE Healthcare	7704-0001	用于密封和储存功能化微孔板。
带低蒸发盖的96孔平底酶标板	Costar	3370
高效液相色谱级水	Sigma Aldrich	270733-4L
3,3′-二乙基硫三碳菁碘化物（DTTC）	Sigma Aldrich	381306-250MG	拉曼探针分子
mPEG-硫醇，分子量 5,000 - 1 克	Laysan Bio, Inc.	MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA，分子量 5,000 - 1 克	Laysan Bio, Inc.	OPSS-PEG-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA 具有 NHS 末端。
小鼠IgG全分子对照	Thermo Fisher Scientific	31903	抗原
山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗	Thermo Fisher Scientific	31164	抗体
人血清白蛋白封闭液	Sigma Aldrich	A1887-1G	可使用牛血清白蛋白替代。
紫外-可见分光光度计	Thermo Scientific	Nanodrop 2000c
紫外-可见分光光度计	BioTek	Synergy 2
自制785 nm倒置拉曼显微镜系统	N/A	N/A	倒置拉曼显微镜最适合对微孔板表面进行精确聚焦。否则，由于96孔板的高度限制，必须使用极低倍率物镜。本研究采用自制系统，因其成本低于从供应商购买成品。然而，任何市售的倒置拉曼显微镜系统均可使用。