通过免疫磁珠阴性选择法从全血中分离单核细胞

摘要

来源：Plaisance-Bonstaff, K.，等。人原代单核细胞的分离、转染与培养。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们演示了通过免疫磁珠负向分离法从全人血中分离单核细胞。分离得到的单核细胞可用于后续下游分析。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 通过免疫磁珠阴性选择法分离原代人单核细胞

1. 在四个 10 mL 的乙二胺四乙酸（EDTA）真空采血管中（每管 10 mL 血液），采集 40 mL 新鲜的人全血（来自 HIV⁺ 患者或健康对照者）。在生物安全柜内采用无菌技术，将全部 40 mL 血液转移至一个 50 mL 圆锥形聚丙烯管中。
2. 根据所选人单核细胞分离试剂盒的说明书（材料表），向血液管中加入试剂盒提供的 2 mL 单核细胞分离混合液。将试剂盒中提供的磁珠涡旋振荡 30 秒，然后向血液管中加入 2 mL。
   1. 若血液量少于 40 mL，需按比例减少所加试剂。使用塑料 25 mL 移液管反复吹打混匀溶液，并在室温（RT）下孵育 5 分钟。
3. 将血液混合物均分为四份，分别加入四个 50 mL 管中，每管加入含 1 mM EDTA 的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）30 mL。使用塑料 25 mL 移液管反复吹打混匀。
4. 将各管放入磁力架中静置 10 分钟，以去除与抗体结合的磁珠。同时使用四个磁力架，每个管一个，以确保各样本的孵育和分离时间一致。
5. 使用移液器在磁力架上从每管中心吸取液体内容物。注意避免吸取红细胞（不超过初始体积 10 mL 的 10%），并将内容物转移至四个新的 50 mL 管之一中。
6. 向每个 50 mL 管中加入 500 µL 经涡旋振荡的磁珠。使用 25 mL 移液管反复吹打混匀，并在室温下孵育 5 分钟。然后将各管放入磁力架中静置 5 分钟。
7. 仍在磁力架上时，小心地从每管中心转移内容物至四个新的 50 mL 管之一中。立即将每个新的 50 mL 管重新放入磁力架中静置 5 分钟。
8. 小心地将每管中心的内容物转移至四个新的 50 mL 管之一中。将所有新的 50 mL 管在 300 x g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，并将四个细胞沉淀重悬于总共 10 mL 无菌 PBS 中。
9. 使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法计数细胞。
   注意：通常从 40 mL 全血中可获得 8–20 × 10⁶ 个细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5M EDTA	Invitrogen	AM9260G
BD Vacutainer 塑料采血管（含K2EDTA）	BD Biosciences	366643
Easy 50 EasySep 磁力架	StemCell Technologies	18002
EasySep 直接人单核细胞分离试剂盒	StemCell Technologies	19669
PBS	Gibco	20012027
含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基	Corning	10040CVMP