来源：Plaisance-Bonstaff, K.，等。原代人单核细胞的分离、转染与培养。J. Vis. Exp. (2019)
本视频展示了将原代单核细胞诱导分化为巨噬细胞的过程。可通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）将原代人单核细胞分离并诱导为类似M1型的促炎表型，或通过巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导为类似M2型的抗炎表型。
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方法文章
原代单核细胞体外培养及向巨噬细胞的分化
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。
1. 通过免疫磁珠阴性选择法分离人原代单核细胞
- 在四个 10 mL 的乙二胺四乙酸（EDTA）真空采血管中（每管 10 mL 血液），采集 40 mL 新鲜的人全血（来自 HIV+ 患者或健康对照者）。在生物安全柜内采用无菌操作技术，将全部 40 mL 血液转移至一个 50 mL 圆锥形聚丙烯管中。
- 根据所选人单核细胞分离试剂盒的说明书（材料表），向血液管中加入试剂盒提供的 2 mL 单核细胞分离混合液。将试剂盒中提供的磁珠涡旋振荡 30 秒，然后向血液管中加入 2 mL。
- 若血液量少于 40 mL，需按比例减少所加试剂。使用塑料 25 mL 移液管反复吹打混匀溶液，并在室温（RT）下孵育 5 分钟。
- 将血液混合物均等地分装至四个 50 mL 管中，每管加入 30 mL 含 1 mM EDTA 的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。使用塑料 25 mL 移液管反复吹打混匀。
- 将各管放入磁力架中静置 10 分钟，以去除与抗体偶联的磁珠。同时使用四个磁力架，每个管一个，以确保各样本的孵育和分离时间一致。
- 将各管仍置于磁力架中，用移液器小心吸取管中心的液体内容物。注意避免吸取红细胞（不超过初始体积 10 mL 的 10%），并将液体转移至四个新的 50 mL 管之一中。
- 向每个 50 mL 管中加入 500 µL 经涡旋振荡的磁珠。使用 25 mL 移液管反复吹打混匀，并在室温下孵育 5 分钟。然后将各管放入磁力架中静置 5 分钟。
- 将各管仍置于磁力架中，小心吸取管中心的液体内容物，转移至四个新的 50 mL 管之一中。立即将每个新的 50 mL 管再次放入磁力架中静置 5 分钟。
- 小心将各管中心的液体内容物转移至四个新的 50 mL 管之一中。将所有新的 50 mL 管在 300 x g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，并将四个管中的细胞沉淀重悬于总共 10 mL 无菌 PBS 中。
- 使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法计数细胞。
注意：通常从 40 mL 全血中可获得 8–20 × 106 个细胞。
2. 原代人单核细胞的培养
- 使用37 °C水浴，将添加了1%青霉素-链霉素（青/链，pen/strep）的无血清RPMI 1640培养基预热，并（在生物安全柜内持续采用无菌操作技术）将分离得到的单核细胞以1 × 106 个细胞/mL的浓度重悬于该培养基中。
- 将1 mL重悬的细胞加入6孔板的每孔中或35 mm培养皿中（最终细胞数量应为1 × 106 个细胞/板），置于37 °C、含5% CO2的培养箱中。静置0.5–1.0小时，使细胞贴壁。
- 使用37 °C水浴预热热灭活（HI）胎牛血清（FBS）。向每孔中加入100 µL FBS（终浓度为10%）。向细胞中加入生长因子以促进巨噬细胞分化。
- 通过向培养基中添加25 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导巨噬细胞向M1样表型极化；通过添加50 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导巨噬细胞向M2样表型极化。
注意：GM-CSF和M-CSF均可促使单核细胞分化为普通巨噬细胞表型（M0），同时分别使细胞向M1或M2表型极化。
- 通过向培养基中添加25 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导巨噬细胞向M1样表型极化；通过添加50 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导巨噬细胞向M2样表型极化。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer 塑料采血管（含 K2EDTA） | BD Biosciences | 366643 | |
| Easy 50 EasySep 磁力架 | StemCell Technologies | 18002 | |
| EasySep 直接人单核细胞分离试剂盒 | StemCell Technologies | 19669 | |
| 经定义、热灭活的胎牛血清 | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Nunc 35 mm 细胞培养皿 | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 重组人 GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| 重组人 M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| 含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基 | Corning | 10040CVMP |
