来源：Tsvilovskyy, V.，等。腹膜来源肥大细胞的分离及其通过Ca2+-成像和脱颗粒实验进行的功能表征。J. Vis. Exp. (2018)。
本视频展示了一种比色法检测肥大细胞脱颗粒活性的实验方法。肥大细胞释放的酶可水解底物并生成有色产物。肥大细胞的脱颗粒活性以细胞外释放的酶量占细胞总酶含量的百分比来表示。
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方法文章
研究靶向化学物质作用的肥大细胞脱颗粒实验
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 腹腔灌洗法分离与培养腹腔巨噬细胞
- 通过腹腔灌洗法分离PMC
- 在细胞分离前，准备好表1中列出的材料。
- 使用8至14周龄的雄性小鼠进行PMC分离。通过吸入CO2处死小鼠，并通过反射消失确认死亡。用70%乙醇喷洒小鼠，然后用针将其固定在泡沫板上（背侧朝下）。使用钝头剪刀去除小鼠腹部皮肤，注意避免损伤腹腔。
注意：本方案通常用于遗传背景为C57BL/6N品系的小鼠。 - 使用配备27 G针头的10 mL注射器，向腹腔内注入7 mL冰冻RPMI培养基和5 mL空气。将针头小心插入腹膜，避免刺穿任何器官。选择附睾脂肪区域作为穿刺点，以降低器官穿孔的风险。
- 注射后，轻轻摇晃小鼠1分钟，使腹腔细胞脱落进入RPMI培养基中。不要剧烈摇晃，以免损伤内脏器官并导致血液污染腹腔液。
- 更换为新的20 G套管，重新使用该10 mL注射器。通过倾斜泡沫板并轻敲实验台面，将内脏移至一侧，以便从另一侧更方便地吸取液体。插入20 G针头（斜面朝上），缓慢轻柔地抽吸腹腔液体（约0.5 mL/s），避免因接触内脏而堵塞针头。尽可能多地收集液体（通常为5–6 mL）。
- 从注射器上取下针头，将收集的细胞悬液转移至预冷的收集管中。若发现明显血液污染，则弃去该样本管。
- 将含有细胞悬液的管子在约300 x g条件下离心5分钟。在无菌操作台中吸除上清液。每只小鼠的细胞沉淀用4 mL冷（4–10 °C）PMC培养基重悬，将细胞悬液转移至25 cm2培养瓶中。加入生长因子IL-3和SCF，使其终浓度分别为10 ng/mL和30 ng/mL。将含细胞的培养瓶置于培养箱中（37 °C，5% CO2），培养约48小时，直至进行下一步操作。
- PMC培养
- 第2天（分离后约48小时）：更换培养基
- 为去除上清液及非贴壁细胞（红细胞和死细胞），将巴斯德移液管尖端置于培养瓶边缘，将培养瓶几乎水平放置后小心吸出培养基。每只小鼠加入4 mL预温的PMC培养基。添加生长因子IL-3（10 ng/mL）和SCF（30 ng/mL）。将含细胞的培养瓶放回培养箱（37 °C，5% CO2）中继续培养。
- 第9天：细胞传代
- 将细胞悬液从培养瓶转移至50 mL塑料离心管中。用10 mL预温（37 °C）的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤培养瓶三次，每次洗涤液均收集至同一50 mL塑料离心管中，以回收脱落的细胞。使用血细胞计数板测定细胞浓度，并计算总细胞数。
- 将细胞悬液在约300 x g条件下离心5分钟，吸除上清液。用预温的PMC培养基（37 °C）重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至1 × 106 cells/mL。将细胞悬液转移至新的25 cm2培养瓶中。弃去底部附着有成纤维细胞的旧培养瓶。
- 加入生长因子IL-3（10 ng/mL）和SCF（30 ng/mL），将含细胞的培养瓶置于培养箱中（37 °C，5% CO2）继续培养。
- 第12–15天：细胞检测
- 若计划进行FcɛRI受体刺激实验，需在标准培养基中用300 ng/mL的抗DNP IgE抗体对细胞进行过夜预处理。
- 第2天（分离后约48小时）：更换培养基
2. 肥大细胞中β-己糖胺酶释放量的测定
- 在测量之前，准备好 表2 中列出的材料。
注意： 肥大细胞（MCs）受到刺激后释放的β-己糖胺酶可将对硝基苯基-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（pNAG）水解为对硝基苯酚和N-乙酰-D-葡萄糖胺。样品中β-己糖胺酶的量与生成的对硝基苯酚的量成正比。在“终止液”的高pH环境中，对硝基苯酚以完全去质子化的对硝基苯酚根形式存在，可通过其在405 nm处的光吸收进行检测。 - 配制含有130 mM NaCl、5 mM KCl、1.4 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM HEPES、5.6 mM葡萄糖和0.1% BSA的Tyrode's溶液。用3 M NaOH将pH值调节至7.4。
- 通过向Tyrode's溶液中加入终体积为1%的Triton X-100来制备裂解液。
- 配制由200 mM甘氨酸组成的终止液，并用NaOH将pH值调节至10.7。
- 将pNAG溶解于0.4 M柠檬酸中，配制成终浓度为4 mM的pNAG溶液（4-硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷）。
- 计算实验所需的细胞数量（实验需设复孔）。每孔使用200,000个PMC。每种基因型设置2孔为阴性对照（不含任何分泌刺激剂如DNP或化合物48/80的Tyrode's溶液），2孔为阳性对照（含10 µM离子霉素的Tyrode's溶液）。
- 将细胞转移至15 mL塑料离心管中，用Tyrode's溶液调整体积至15 mL，在200 × g 条件下离心4分钟。用巴斯德吸管移除上清液，并将细胞重悬于Tyrode's溶液中，使细胞浓度为2 × 106 个/mL。
- 将100 µL细胞悬液加入96孔V型底板的每孔中。向每孔加入25 µL刺激液或对照液（根据 图1A 所示加样方案）。将细胞在37 °C、5% CO2 条件下孵育45分钟。
- 将96孔板置于冰上5分钟以终止反应。然后在4 °C、120 × g 条件下离心4分钟。使用多通道移液器将120 µL上清液转移至平底96孔板中，并置于冰上。操作时小心避免触碰细胞沉淀，但需完全吸走上清液。
- 向细胞沉淀中加入125 µL裂解缓冲液。室温孵育5分钟后，通过反复吹打（约5次）重悬细胞沉淀。
- 在新的平底96孔板中，向所需孔中加入25 µL pNAG溶液（4 mM）。再向每孔中加入25 µL上清液以及25 µL细胞裂解液。
- 将反应体系在37 °C孵育1小时。孵育结束后，向每孔加入150 µL终止液以终止反应。
- 使用酶标仪在405 nm波长下进行检测，参考波长设为630 nm，以实现自动背景扣除。在采集程序中勾选“参考”选项，并在“吸光度”程序元素菜单中从下拉列表选择“630 nm”。若样品的光密度值过高，应在重新测量前对样品进行适当稀释。
表1：步骤1所需材料。
| 1 | 冰 |
| 2 | 10 mL 注射器 |
| 3 | 27 G 针头 |
| 4 | 20 G 针头 |
| 5 | 泡沫塑料块和固定针 |
| 6 | 收集管（50 mL 塑料离心管） |
| 7 | 70% 乙醇 |
| 8 | RPMI 培养基（预冷并置于冰上） |
| 9 | PMC 培养基：RPMI 培养基 + 20% FCS（胎牛血清）+ 1% 青霉素-链霉素溶液（Pen-Strep） |
| 10 | 杜氏磷酸盐缓冲液 - DPBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+） |
| 11 | 培养瓶（25 cm） |
| 12 | 生长因子储备液（IL-3：1 μg/μL；SCF：2.5 μg/mL） |
| 13 | 血清移液管（10 mL） |
| 14 | 无菌移液器吸头（20–200 µL） |
| 15 | 血细胞计数板 |
| 16 | 台式离心机 |
| 17 | 剪刀和镊子 |
| 18 | 小鼠用 CO2 麻醉室 |
| 19 | 开放式无菌操作台 |
| 20 | 封闭式无菌操作台 |
| 21 | 细胞培养箱（37 °C 和 5% CO2） |
| 22 | 移液器（20–200 µL） |
表2：步骤2所需材料。
| 1 | PMC（12–15 天龄）1 × 106 个细胞/mL |
| 2 | 抗-DNP-抗体（IgE）储备液 |
| 3 | DNP-HSA 储备液 |
| 4 | 化合物 48/80 储备液 |
| 5 | 离子霉素 |
| 6 | 96 孔板，V 型底 |
| 7 | 96 孔板，平底 |
| 8 | 塑料离心管（15 mL） |
| 9 | 血清移液管 |
| 10 | 细胞培养箱（37 °C 和 5% CO2） |
| 11 | 台式离心机 |
| 12 | 用于光密度测定的酶标仪 |
| 13 | 多通道移液器（20–200 μL） |
| 14 | 血细胞计数板 |
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结果
图 1： 使用从野生型小鼠分离的原代肥大细胞（PMCs）进行的β-己糖胺酶释放比色法多孔板检测结果。 （A）用于β-己糖胺酶检测的96孔板加样刺激方案；结果见B图。“Spontan”表示仅加入Tyrode溶液，不添加任何分泌刺激剂；IM = 钙离子载体Ionomycin；Cp 48/80 = 化合物48/80。（B）柱状图显示在基础状态（Spont）、以及用Ionomycin（IM）、二硝基苯-人血清白蛋白（DNP）和化合物48/80（Cp 48/80）以指定浓度刺激后，β-己糖胺酶释放的百分比。实验重复进行两次；误差线表示均值的标准误。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 培养基 | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-抗体 | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-硝基苯基 2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷 | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell 成像腔室 | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96孔板，V型底 | Corning | 3896 | |
| 96孔板，平底 | Greiner Bio-One | 655180 | |
| 配备 "i-control" 软件 的酶标仪 | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| 平底板 | Greiner Bio-One | 655180 | |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL 塑料离心管 | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 细胞培养瓶 (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| 血细胞计数板 | VWR | 631-0696 | |
| 单色光源 | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| 15 mL 塑料离心管 | Sarstedt | 6,25,54,502 | |
| 台式离心机 | Heraeus | Megafuge 1.0R |
