研究靶向化学物质作用的肥大细胞脱颗粒实验

摘要

来源：Tsvilovskyy, V.，等。腹膜来源肥大细胞的分离及其通过Ca²⁺-成像和脱颗粒实验进行的功能表征。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种比色法检测肥大细胞脱颗粒活性的实验方法。肥大细胞释放的酶可水解底物并生成有色产物。肥大细胞的脱颗粒活性以细胞外释放的酶量占细胞总酶含量的百分比来表示。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 腹腔灌洗法分离与培养腹腔巨噬细胞

1. 通过腹腔灌洗法分离PMC
   1. 在细胞分离前，准备好表1中列出的材料。
   2. 使用8至14周龄的雄性小鼠进行PMC分离。通过吸入CO₂处死小鼠，并通过反射消失确认死亡。用70%乙醇喷洒小鼠，然后用针将其固定在泡沫板上（背侧朝下）。使用钝头剪刀去除小鼠腹部皮肤，注意避免损伤腹腔。
      注意：本方案通常用于遗传背景为C57BL/6N品系的小鼠。
   3. 使用配备27 G针头的10 mL注射器，向腹腔内注入7 mL冰冻RPMI培养基和5 mL空气。将针头小心插入腹膜，避免刺穿任何器官。选择附睾脂肪区域作为穿刺点，以降低器官穿孔的风险。
   4. 注射后，轻轻摇晃小鼠1分钟，使腹腔细胞脱落进入RPMI培养基中。不要剧烈摇晃，以免损伤内脏器官并导致血液污染腹腔液。
   5. 更换为新的20 G套管，重新使用该10 mL注射器。通过倾斜泡沫板并轻敲实验台面，将内脏移至一侧，以便从另一侧更方便地吸取液体。插入20 G针头（斜面朝上），缓慢轻柔地抽吸腹腔液体（约0.5 mL/s），避免因接触内脏而堵塞针....

结果

图 1： 使用从野生型小鼠分离的原代肥大细胞（PMCs）进行的β-己糖胺酶释放比色法多孔板检测结果。 （A）用于β-己糖胺酶检测的96孔板加样刺激方案；结果见B图。“Spontan”表示仅加入Tyrode溶液，不添加任何分泌刺激剂；IM = 钙离子载体Ionomycin；Cp 48/80 = 化合物48/80。（B）柱状图显示在基础状态（Spont）、以及用Ionomycin（IM）、二硝基苯-人血清白蛋白（DNP）和化合物48/80（Cp 48/80）以指定浓度刺激后，β-己糖胺酶释放的百分比。实验重复进行两次；误差线表示均值的标准误。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 培养基	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
DNP-HSA 	Sigma-Aldrich	A6661
Anti-DNP-抗体 	Sigma-Aldrich	D-8406
青霉素-链霉素	Thermo Scientific	15140122
Compound 48/80 	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇	Sigma-Aldrich	X100
4-硝基苯基 2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷	Sigma-Aldrich	N9376
CoverWell 成像腔室	Sigma-Aldrich	GBL635051
96孔板，V型底 	Corning	3896
96孔板，平底	Greiner Bio-One	655180
配备 "i-control" 软件 的酶标仪	Tecan	Nano Quant, infinite M200 Pro
平底板 	Greiner Bio-One	655180
离子霉素	Sigma-Aldrich	I9657
50 mL 塑料离心管	Sarstedt	62.547.254 
细胞培养瓶 (25 cm)	Greiner Bio-One	69160
血细胞计数板	VWR	631-0696
单色光源	Sutter Instruments	Lambda DG-4
15 mL 塑料离心管	Sarstedt	6,25,54,502
台式离心机	Heraeus	Megafuge 1.0R