小鼠库普弗细胞的分离与培养

摘要

来源：Bourgognon, M.，等。用于纳米颗粒毒性测试的库普弗细胞分离。J. Vis. Exp. (2015)

在本视频中，我们演示从小鼠肝脏中分离库普弗细胞（即肝脏巨噬细胞）的方法。通过灌注消化液对肝脏进行处理，随后进行密度梯度离心分离。所获得的贴壁库普弗细胞可用于后续分析。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 灌注与细胞收集（图1）

1. 根据材料表中所述，新鲜配制所有试剂。
2. 将EGTA（乙二醇四乙酸）/HBSS（Hanks平衡盐溶液）溶液（每只小鼠50 ml）和胶原酶溶液（每只小鼠100 ml）在40 °C下预热30分钟。
3. 先用70%乙醇冲洗泵的软管。将40 ml EGTA/HBSS溶液倒入置于水浴中的离心管内，用预热的EGTA/HBSS溶液冲洗泵的软管。
4. 使用巴比妥类药物进行终末麻醉，以在呼吸抑制和死亡前可靠地诱导无意识状态。向雌性或雄性CD1小鼠（35-45 g）腹腔注射1 mg/kg的苯巴比妥钠。通过脚趾夹捏法确认麻醉效果。
5. 剃除腹部毛发，并使用70%乙醇溶液对腹部表面进行消毒。
6. 切开腹腔，将肠道向腹部左侧外侧移动，暴露门静脉和下腔静脉。
7. 以1-3 ml/min的流速启动泵，使用EGTA/HBSS溶液并通过23 G蝶形针（剪去翼部）插管门静脉。用夹子固定插入23 G针头的门静脉段，然后将止血钳翻转至小鼠打开的腹腔表面。在EGTA/HBSS溶液灌注的前30秒内，肝脏应迅速变苍白。
8. 迅速切开下部的下缘 下腔静脉 为避免肝脏内压力过高，灌注开始后的第一分钟内，逐渐将流速增加至7 ml/min。动物因下腔静脉穿刺导致的继发性出血而死亡。
9. 当离心管中EGTA/HBSS溶液剩余量少于5 ml时，用胶原酶溶液补足至40–50 ml。在30秒内将流速逐渐增加至10 ml/min。
10. 通过按压下腔静脉使肝脏肿胀 下腔静脉使用镊子夹住，每次持续5-10秒，可定期重复此操作（消化过程中进行5-10次）。该步骤有助于提高肝细胞的解离效果，并缩短胶原酶灌注时间。
11. 当离心管中剩余的胶原酶溶液少于10 ml时，向离心管中加入40–50 ml预热的胶原酶溶液。
12. 灌注10-15分钟后，当已灌注约70-80 ml胶原酶溶液时，用镊子轻轻按压肝脏表面。若出现压痕，表明肝细胞已解离。
13. 将肝脏完整地从腹腔中取出，放入含有20–30 ml库普弗细胞分离培养基的离心管中。将肝细胞置于冰上或4 °C环境中，最长不超过3小时，以避免影响肝细胞活力。
14. 如有需要，对多只动物重复灌注操作，同时将已灌注的肝脏置于冰上。合并一至三只肝脏用于纯化，并进行第3阶段操作。

2. 离心用密度梯度的制备（图2）

1. 继续执行以下步骤（第2、3节 &在无菌条件下进行操作，并将细胞置于冰上或4 °C保存。通过将15.3 ml包被二氧化硅颗粒溶液与1.7 ml 10 × PBS混合，制备等渗包被二氧化硅颗粒溶液（SIP）。
2. 配制20 ml的25% SIP溶液：将5 ml SIP与15 ml PBS混合。配制20 ml的50% SIP溶液：将10 ml SIP与10 ml PBS混合。
3. 用一个离心管加入20 ml的50% SIP溶液。将离心管倾斜至接近90°角，使用25 ml血清移液管沿管壁缓慢加入25% SIP溶液（20 ml），避免接触50% SIP液层的表面。在加入25% SIP溶液的过程中，逐渐减小离心管的倾斜角度。将密度梯度置于冰上保存，直至使用。

3. 枯否细胞纯化（图3）

1. 将一个灌注过的肝脏放入含有15 ml库普弗细胞分离培养基的培养皿中。使用剪刀撕破格利森囊（肝脏的膜），并将所有肝细胞释放到库普弗细胞分离培养基中。通过100 µm细胞筛过滤溶液，收集至离心管中。对其他灌注过的肝脏重复灌注操作，并将细胞汇集至同一离心管中（一只小鼠可得15 ml，最多三只小鼠可得45 ml）。
2. 在4 °C条件下，以50 × g离心2分钟，使细胞悬液沉淀。实质细胞（肝细胞）将形成沉淀，而非实质细胞（包括库普弗细胞）则保留在上清液中。
3. 将上清液转移至洁净的离心管中，以50 × g离心2分钟。重复此步骤三次。
4. 以1,350 × g离心15分钟，沉淀非实质细胞。弃去上清液，并将沉淀重悬于10 ml库普弗细胞分离培养基中。
5. 将非实质细胞悬液加至25/50%不连续等渗梯度液（如2.3节所述）。以850 × g离心15分钟，离心过程中不启用加速或刹车功能。
6. 在25% SIP组分中靠近25/50% SIP界面处，可观察到呈浑浊状的富集库普弗细胞组分（图3）。使用10 ml移液管，吸取约12 ml富集的库普弗细胞组分，转移至含有35–40 ml库普弗细胞分离培养基的离心管中。轻轻混匀后，在4 °C条件下以1,350 × g离心15分钟，使细胞沉淀。
7. 弃去上清液，将细胞重悬于5–10 ml预温的库普弗细胞培养基中。进行细胞计数（血细胞计数板），并使用台盼蓝染色法测定细胞活力。
8. 将纯化的非实质细胞以每孔5 × 10⁵个细胞的密度接种于24孔板中。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养（图3）。30分钟后，轻轻吸除培养基，用预温的Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤一次，然后每孔加入500 µl新鲜且预温的库普弗细胞培养基。

结果

图1：肝脏灌注。 小鼠麻醉后，将消化道向腹腔左侧移位，以暴露门静脉（PV）。使用EGTA/HBSS溶液以缓慢流速（1–3 ml/min）对门静脉进行插管灌注，同时立即切开下腔静脉（IVC），以防止肝脏内压力过高。灌注开始后的第一分钟内，逐渐将流速提高至7 ml/min。随后以10 ml/min的流速灌注胶原酶溶液，直至肝脏完全消化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
戊巴比妥钠	Merial
CD1小鼠	Charles River	—	小鼠体重应在35至45克之间。建议使用雄性CD1小鼠，因其体重增长迅速（例如，7周龄的雄性CD1小鼠体重即可超过35克）。建议提前联系动物供应商，安排提供年龄较大的动物。或者，也可在本单位饲养动物以达到所需体重。
HBSS（无Ca<sup>2+</sup>和Mg<sup>2+</sup>，含碳酸氢盐）	Life Technologies	14175-053	HBSS必须不含Ca<sup>2+</sup>。
乙二醇双四乙酸（EGTA）四钠盐	Sigma-Aldrich	E8145	也可使用EDTA，但EGTA的优势在于可选择性螯合Ca<sup>2+</sup>&nbsp;。
HEPES（1 M）	Life Technologies	15630-056	100 ml
IV型胶原酶	Worthington	CSL-4	建议测试不同批次的胶原酶，或至少向供应商说明该产品需适用于肝细胞分离
低糖DMEM	Sigma-Aldrich	D5523	500 ml
RPMI（含丙酮酸钠和Glutamax&reg;）	Life Technologies	12633-012	500 ml
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140-122	100 ml
胎牛血清	First-Link	60-00-850	500 ml
台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich	T8154	100 ml
包被二氧化硅颗粒溶液（Percoll&reg;）	GE Healtcare	17-0891-02	Percoll&reg;非常稳定，可保存数年
1×磷酸盐缓冲液	Life Technologies	10010-023	500 ml
10×磷酸盐缓冲液	Life Technologies	70011-036	500 ml
蝶形采血套装（23G，305 mm长管）	BD	367288
注射器滤器（0.22 &mu;m 蓝边）	Minisart	16534-K
离心管（50 ml 蓝盖）	BD Biosciences, Falcon	35 2070
培养皿（90 × 15 mm）	Thermo Fisher Scientific	BSN 101VR20
100 &mu;m 细胞筛	BD	352360
蠕动泵	Watson Marlow	SciQ 300	每次使用前后均需用无菌PBS和70%乙醇冲洗管路。
24孔板	Corning	3526
离心机	Eppendorf	5810R
Serrefine镊子	Hammacher GmbH	Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051	Serrefine镊子可在灌注过程中夹住插入23G针头的血管，无需手动持握镊子。网址：(http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
细胞刮刀	BD Biosciences, Falcon	353086	使用剪刀剪去刀片两端，以便在24孔板中刮取细胞。
EGTA（乙二醇双四乙酸）/HBSS（Hank's平衡盐溶液）溶液			含0.5 mM EGTA和25 mM HEPES的HBSS。调节pH至7.4。每灌注一个肝脏准备50 ml。
胶原酶溶液			低糖DMEM，含100 U/ml IV型胶原酶、15 mM HEPES和1%青霉素/链霉素（v/v）。调节pH至7.4。每灌注一个肝脏准备100 ml。加入胶原酶后，建议将溶液预热30分钟再使用，以确保胶原酶活性达到最佳。
库普弗细胞分离培养基			RPMI，含1%非必需氨基酸（v/v）、1% Glutamax&reg;（v/v）和1%青霉素/链霉素（v/v）。每1–3个肝脏至少准备100 ml。
库普弗细胞培养培养基			RPMI，含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸（v/v）、1% Glutamax&reg;（v/v）和1%青霉素/链霉素（v/v）。每1–3个肝脏至少准备100 ml。
SIP（等渗包被二氧化硅颗粒溶液）			将1.7 ml 10×磷酸盐缓冲液与15.3 ml Percoll&reg;混合，得到17 ml SIP。
25% SIP溶液			将5 ml SIP与15 ml 1×磷酸盐缓冲液混合
50% SIP溶液			将10 ml SIP与10 ml 1×磷酸盐缓冲液混合
裂解缓冲液			含0.9% Triton X-100的DMEM培养基
PBS/BSA溶液			新鲜配制pH 7.4的磷酸盐缓冲液，含1%牛血清白蛋白。