人诱导性多能干细胞向巨噬细胞的分化

摘要

来源：Lopez-Yrigoyen, M.，等。由多能干细胞生成和表征人巨噬细胞。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频介绍了一种 体外 从人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成巨噬细胞的方法。iPSCs向巨噬细胞的生成过程分为三个阶段：（i）iPSCs在悬浮状态下聚集形成三维拟胚体（EBs），进而分化为中胚层细胞；（ii）由分化的拟胚体生成巨噬细胞前体细胞；（iii）巨噬细胞前体细胞进一步分化为成熟且具有功能的巨噬细胞。

方案

1. 人iPSC向巨噬细胞的分化

注意：巨噬细胞分化方案的示意图总结见图1。

1. 准备细胞分化生长因子及其他试剂
   1. 通过在DMEM/F12培养基中添加hESC补充剂、1.8% w/v牛血清白蛋白（BSA）和0.1 mM 2-巯基乙醇，配制人胚胎干细胞无血清培养基（hESC-SFM；参见材料表）。
   2. 将明胶溶于无菌水中，配制成0.1% w/v的猪明胶溶液。明胶溶液可在4 °C保存长达2年。
   3. 将BMP4溶解于含4 mM盐酸（HCl）和0.2% BSA的PBS溶液中，配制人骨形态发生蛋白（BMP4）储存液（25 μg/mL）。将储存液分装至冻存管中，每管50 μL。储存液可在-20 °C保存长达1年。解冻后，BMP4储存液可在4 °C保存5天。
   4. 将VEGF溶解于0.2% BSA的PBS溶液中，配制人血管内皮生长因子（VEGF）储存液（100 μg/mL）。将储存液分装至冻存管中，每管10 μL。储存液可在-20 °C保存长达1年。解冻后，VEGF储存液可在4 °C保存7天。
   5. 将SCF溶解于0.2% BSA的PBS溶液中，配制人干细胞因子（SCF）储存液（100 μg/mL）。将储存液分装至冻存管中，每管5 μL。储存液可在-20 °C保存长达1年。解冻后，SCF储存液可在4 °C保存10天。
   6. 将IL3溶解于0.2% BSA的PBS溶液中，配制人白细胞介素-3（IL3）储存液（10 μg/mL）。将储存液分装至冻存管中，每管500 μL。储存液可在-20 °C保存长达2年。解冻后，IL3储存液可在4 °C保存15天。
   7. 将CSF1溶解于0.2% BSA的PBS溶液中，配制人巨噬细胞集落刺激因子（CSF1）储存液（10 μg/mL）。将储存液分装至冻存管中，每管1 mL。储存液可在-20 °C保存长达2年。解冻后，CSF1储存液可在4 °C保存15天。
2. 阶段1：类胚体形成（第0天至第3天）
   1. 在第0天，向超低吸附6孔板的两个孔中各加入2.25 mL阶段1培养基（hESC-SFM培养基中添加50 ng/mL BMP4、50 ng/mL VEGF和20 ng/mL SCF）。
   2. 将6孔板中一个汇合度为80%的iPSC孔中的维持培养基更换为1.5 mL阶段1培养基。
   3. 使用细胞传代工具切割集落，并用移液器将切割后的集落转移至超低吸附6孔板的两个孔中（参见材料表）。
   4. 在第2天，向培养体系中加入0.5 mL hESC-SFM培养基，使细胞因子终浓度达到50 ng/mL BMP4、50 ng/mL VEGF和20 ng/mL SCF。
      注意：iPSC集落将形成类胚体（EB）（图2A）。
3. 阶段2：悬浮液中造血细胞的出现
   1. 在第4天，用0.1% w/v明胶包被6孔组织培养板中的4个孔，孵育至少10分钟。
   2. 去除明胶溶液，每孔加入2.5 mL阶段2培养基（X-VIVO15培养基中添加100 ng/mL CSF1、25 ng/mL IL-3、2 mM GlutaMAX、1%青霉素-链霉素和0.055 mM 2-巯基乙醇）。
   3. 将形成的类胚体收集至50 mL离心管中，静置使其自然沉降至管底，小心吸除上清液。
   4. 用2 mL阶段2培养基重悬类胚体。
   5. 将10–15个类胚体（不超过15个）转移至含2.5 mL阶段2培养基的明胶包被孔中。
   6. 将类胚体在37 °C、5% CO₂条件下孵育。
   7. 每3–4天更换一次贴壁类胚体的培养基，持续2–3周。
   8. 2–3周后，类胚体开始向悬浮液中释放非贴壁性造血细胞。
      注意：悬浮细胞释放的时间可能因细胞系而异。该悬浮液中的细胞可被收集并进一步成熟为巨噬细胞（见阶段3）（图2A）。
4. 阶段3：巨噬细胞终末成熟
   1. 收集悬浮的造血细胞，并向类胚体培养板中补充新鲜培养基（阶段2培养基）。
   2. 在200 x g条件下离心悬浮细胞3分钟。
   3. 用阶段3培养基（X-VIVO15培养基中添加100 ng/mL CSF1、2 mM GlutaMAX和1%青霉素-链霉素）重悬细胞。
   4. 将收集并离心后的细胞以0.2 x 10⁶ cells/mL的密度接种至未处理的10 cm细菌级塑料培养皿（10 mL）或未包被的6孔组织培养板（3 mL）中。
   5. 在阶段3培养基中培养细胞9–11天，每5天更换一次培养基。
      注意：阶段3中的步骤1.4.1–1.4.5可每3–4天重复一次，可持续从原始类胚体板中收集悬浮细胞，最长可达3个月。

结果

图 1：iPSC 分化为成熟功能性巨噬细胞的图示总结。 示意图使用 Biorender 绘制。

图 2：iPSC 向巨噬细胞分化及 iPSC-DM 的数量与形态。 （

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CellMask 深红色细胞膜染料	Thermofisher	C10046	冻存培养基
Cryostor CS10	Sigma	C2874
CTS CELLstart 培养基质	Invitrogen	A1014201	干细胞培养基质
猪皮明胶	Sigma	G9136
重组人 BMP4 蛋白	R&D	314-BP-010
重组人 IL3	Preprotech	0200-03-10
重组人 MCSF（无载体）100μg	Biolegend	574806
重组人 VEGF 蛋白	R&D	293-VE-010
SCF（c-Kit 配体）重组人蛋白	Thermofisher	PHC2111
StemPro hESC SFM	Thermofisher	A1000701
StemPro EZPassage 一次性干细胞传代工具	Thermofisher	23181010
超低吸附板：细胞培养多孔板，6 孔，Cell Star 抗细胞黏附表面	Greiner	657970
2-巯基乙醇（50 mM） 	Invitrogen 	31350010
DPBS，含钙、镁（500 ml）	Thermofisher 	14040091
GlutaMAX 添加剂 	Thermofisher 	35050061