利用机械解离法从小鼠背根神经节中分离巨噬细胞

摘要

来源：Yu, X., 等 背根神经节巨噬细胞的快速分离。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种无需使用酶的机械解离技术，用于从小鼠背根神经节（DRG）中分离巨噬细胞。在对新鲜采集的DRG组织进行匀浆处理后，使用针对巨噬细胞表面受体的抗体对细胞进行荧光标记，随后通过流式细胞术确认样本中巨噬细胞的存在。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

所有动物实验均经加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。

1. 采集实验小鼠的腰段背根神经节

1. 实验开始前，通过将9体积的密度梯度介质（如Percoll）与1体积的Ca⁺⁺/毫克⁺⁺无钙镁10倍HBSS。置于冰上。
2. 用2.5%阿佛丁麻醉小鼠。通过轻捏后肢足垫无反应确认动物已完全麻醉。
   注意使用6至8周龄的雄性和雌性小鼠。
3. 用10 mL预冷的1×PBS对小鼠进行心脏灌注。
   1. 将小鼠仰卧位固定于通风橱内，用胶带固定四肢。用镊子提起肋骨下方的皮肤，用手术剪做一小切口，暴露肝脏和膈肌。
   2. 继续使用剪刀剪开膈肌和肋骨笼，打开胸膜腔以暴露跳动的心脏。
   3. 用虹膜剪迅速剪开右心耳。观察到出血后，将30 G针头插入左心室后端，缓慢注入10 mL预冷的1×PBS，以灌注动物。
4. 进行背侧椎板切除术 在俯卧位的小鼠上。
   注意： 若计划进行细胞培养，应在切开前用70%乙醇喷洒小鼠，并使用预先灭菌的手术器械进行解剖。
   1. 使用11号手术刀，从胸区开始沿侧方纵向向骶区做一深部切口。用剪刀剥离皮肤，暴露背侧肌层。
   2. 使用Friedman-Pearson咬骨钳剥离结缔组织和肌肉，直至暴露腰骶椎棘突及双侧横突。
   3. 使用 Noyes 弹簧剪小心打开背部脊柱，然后换用 Friedman-Pearson 咬骨钳去除椎骨，以暴露带有完整附着脊神经的脊髓。
5. 仔细分离同侧和对侧腰段背根神经节（本研究中为 L4/L5 背根神经节），并将其置于 1 mL 冰冷的 Ca⁺⁺/毫克⁺⁺在Dounce组织研磨器中用无钙镁1×HBSS悬浮组织。现在组织已准备好进行步骤2。
   注意： 如果可能，剪除附着在背根神经节上的脊神经。

2. 从小鼠腰段背根神经节中分离单个细胞

1. 使用Dounce匀浆器中的松散研杵匀浆DRG组织 20-25 次
2. 将无菌的70 μm尼龙细胞滤网置于无菌的50 mL锥形管中。用800 μL预冷的1x HBSS润湿细胞滤网，滤过液收集于锥形管中。
3. 用移液器从匀浆器中吸取匀浆后的组织悬液，经湿润的70 μm尼龙细胞滤网过滤至50 mL锥形管中。
4. 用800 μL预冷的1x HBSS冲洗匀浆器两次，然后将冲洗液倒入同一支含有细胞筛网的50 mL锥形管中，以提高得率。
5. 向无菌的5 mL聚苯乙烯FACS管中加入1.5 mL已平衡的冰冻等渗密度梯度介质（按步骤1.1制备）。
6. 将步骤2.4中的细胞匀浆从50 mL锥形管转移至FACS管中，通过吹打充分混匀与密度梯度介质。再加入500 μL 1×HBSS以封闭上层。
7. 通过离心（800 × g）沉淀细胞 x g 4 °C 下孵育 20 分钟。
8. 小心吸取FACS管底部细胞沉淀上方含有髓鞘的上清液，注意不要扰动管底的细胞沉淀。
9. 用含5%胎牛血清（FBS）的PBS或FACS缓冲液重悬细胞，用于FACS分析。
   注意： 从小鼠L4/L5背根神经节（DRG）预计可获得至少50,000至100,000个细胞。
   1. 将机械分离的DRG细胞（L4/L5）重悬于100 μL含5%胎牛血清的PBS中，然后加入α-小鼠CX3CR1-APC抗体（1:2,000），4 °C避光孵育1小时。
   2. 用 5 mL PBS 洗涤细胞一次；以 360 x g 离心细胞 g 4 °C下离心8分钟。
   3. 吸弃上清液，然后将细胞沉淀重悬于300 μL PBS中用于FCAS分析。若计划进行细胞分选，则将细胞重悬于FACS缓冲液中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AP20187	Clontech	635058
小鼠 CX3CR1-APC 抗体	Biolegend	149007
Avertin	Sigma	T48402
细胞滤筛（70 mm 尼龙）	Falcon	352350
离心机	Eppendorf	5810R
Dounce 组织匀浆器	Wheaton	357538 (1ml)
FACS 管（5ml）	Falcon	352052
Friedman-Pearson 骨钳	FST	16121-14
HBSS（10倍浓度，不含 Ca++/Mg++）	Gibco	14185-052
Noyes 弹簧剪	FST	15012-12
Percoll	Sigma	P4937-500ml
碘化丙啶	Sigma	P4864-10ml