所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。
1. 手术切除和组织制备步骤：
- 小肠（SI）的手术切除
- 使用 CO2 窒息法或机构动物伦理委员会批准的任何等效方法处死小鼠。
- 将小鼠转移至专用的手术切除区域。使其背部朝下放置，并用 70% 乙醇对腹部进行消毒。沿中线从耻骨至肋骨处切开腹壁皮肤和腹膜，打开腹腔。
注意：初次切口应选择在皮肤较小区域进行，以避免穿透腹腔并损伤肠组织。继续切开直至达到所需的解剖边界。
- 识别盲肠，其为检测回肠末端（小肠远端部分）的理想解剖标志。
注意：盲肠通常位于小鼠腹部的左下侧。
- 精确定位回盲交界处，并尽可能在远端水平进行切割，以分离小肠与盲肠。在后续步骤中，应避免过度接触肠壁，因为脆弱的派伊尔结（PPs）在触碰时容易塌陷。
- 使用剪刀剪断肠系膜，轻柔地将整个小肠从盲肠端取出直至幽门括约肌。识别幽门与十二指肠的交界处，并在此水平剪断十二指肠，从而完全将小肠从腹腔中分离。
注意：(i) 避免过度拉伸，以免导致肠壁破裂。 (ii) 若除派伊尔结淋巴细胞外还需分离固有层（LP）淋巴细胞，则必须完全去除肠系膜脂肪。然而，若仅用于派伊尔结的分离，保留部分肠系膜脂肪可能在后续分离步骤中提供一定益处，因此应予以保留。
- 将分离的小肠置于盛有冷 RPMI + 10% 胎牛血清（FBS）的 6 孔板中，并手动轻轻搅动组织，直至所有肠段均浸没于冷培养基中。在后续步骤中始终将组织置于冰上保存。
- 在解剖完所需数量的小鼠小肠后，继续从收集的小肠中进行派伊尔结的切除。
- 派伊尔结的手术切除及单细胞悬液制备：
- 用镊子夹住肠系膜脂肪，将小肠轻柔转移至纸巾上，并使肠系膜侧朝向纸巾。用冷 RPMI + 10% FBS 润湿整个肠段，以防止组织脱水和粘连。
注意：保留的肠系膜脂肪在此阶段可能有所帮助，因为小肠肠系膜侧的脂肪组织会粘附在纸巾上，使对侧（非肠系膜侧）朝上，便于操作。
- 识别派伊尔结，其在肠壁非肠系膜侧呈现为白色、多叶状、类似“花椰菜”形态的聚集结构。
注意：在完成所有派伊尔结切除前，不建议冲洗肠腔内容物。排空肠腔内容物可能导致派伊尔结塌陷，并消除派伊尔结与肠壁之间的颜色对比，而该对比对于派伊尔结的视觉识别非常有帮助。
- 在非肠系膜侧识别派伊尔结后，将手术弯头剪刀置于派伊尔结上方（弯曲端朝上），从其远端和近端边缘固定派伊尔结。
可选：可用指尖轻柔地将派伊尔结推向剪刀刀刃。此操作有助于更好地排除周围非派伊尔结组织。轻柔切除派伊尔结，避免带入周围肠组织。
注意：(i) 此步骤至关重要，旨在最大化获取派伊尔结细胞产量的同时，最小化来自邻近肠区室（如固有层和肠上皮）的细胞污染，这些区域同样富含 T 细胞。(ii) 从小鼠（C57BL/6 品系）切除的一段小肠中，通常可收集 5–10 个派伊尔结（平均大小，多叶状）。若目标为更小的派伊尔结（非多叶状），使用本方案每只小鼠（C57BL/6）最多可收集 12–13 个派伊尔结。
- 用镊子或弯头手术剪将切除的派伊尔结转移至盛有冰冻 RPMI + 10% FBS 的 12 孔细胞培养板中，并置于冰上保存。
注意：(i) 派伊尔结切除后，应立即用纸巾轻柔擦拭其表面，以清除黏液和肠内容物。此步骤有助于提高派伊尔结淋巴细胞的存活率。(ii) 除转移至培养板外，也可根据总样本数量考虑将派伊尔结转移至独立的离心管中。
- 可选：当派伊尔结切除并转移至培养板后，可通过拍摄含派伊尔结的细胞培养板照片，记录不同实验组或小鼠组中收集的派伊尔结数量和大小。
- 准备若干 50 mL 锥形管，每管加入 25 mL 预热至 37 °C 的 RPMI + 10% FBS。使用剪刀剪去 1,000 µL 枪头的尖端，使其开口大小适中，便于用 1 mL 移液器吸取派伊尔结。用 1 mL 移液器吸取派伊尔结，并将其从 12 孔细胞培养板转移至已准备好的 50 mL 锥形管中。
注意：每个小鼠样本应使用新的枪头，以避免样本间的交叉污染。
- 盖紧管盖，将锥形管垂直置于 37 °C 摇床中，以 125–150 rpm 持续振荡 10 分钟。同时，准备另一组 50 mL 锥形管，并在每管顶部放置 40 µm 细胞筛网，用于后续制备单细胞悬液。
注意：(i) 振荡步骤可去除残留的肠内容物、黏液和细胞碎片，若不除去这些物质，将降低派伊尔结淋巴细胞的存活率和回收率。(ii) 不应在派伊尔结组织上使用任何消化酶，因为消化过程会导致细胞表面 CXCR5 表达显著下降。
- 振荡结束后，将派伊尔结转移至置于新准备的 50 mL 锥形管顶部的 40 µm 细胞筛网上。使用 10 mL 注射器活塞的圆头端，轻柔地将派伊尔结压过筛网，以制备单细胞悬液。用 15–20 mL 冷 RPMI + 10% FBS 冲洗筛网。
注意：(i) 过滤前，水平轻摇含派伊尔结的锥形管。此短暂摇动有助于将派伊尔结转移至细胞筛网中。(ii) 建议使用 70 µm 细胞筛网用于非淋巴样免疫细胞（例如，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞）的分离。
- 将单细胞悬液在 4 °C 条件下以 350–400 x g 离心 10 分钟。
- 小心弃去上清液，将细胞重悬于浓度为 10 x 106 细胞/mL 的溶液中。使用血细胞计数板进行细胞计数。