从人血沉棕黄层中分离外周血单个核细胞

摘要

来源：Mily, A., 等 人源单核细胞来源的M1与M2型极化及流式细胞术分析 结核分枝杆菌 感染。 视频实验杂志 (2020)

在本视频中，我们演示了通过密度梯度离心法从人血沉棕黄层中分离外周血单个核细胞（PBMCs），其中包括单核细胞和淋巴细胞。分离得到的PBMCs可用于后续分析。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际关于人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 培养基的制备

注意： 所有试剂和耗材的详细信息均在材料表中提供。

1. RPMI 完全培养基：在 RPMI 1640 培养基中添加 1 mM 丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、10 mM HEPES 和 10% 热灭活胎牛血清（FBS）。在进行结核分枝杆菌（Mtb）感染实验时，避免在细胞培养基中使用抗生素。
2. 无血清 RPMI 培养基：在 RPMI 1640 培养基中添加 1 mM 丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺和 10 mM HEPES。

2. 从血沉棕黄层分离外周血单个核细胞

注意：所有涉及人血（可能具有传染性）的操作均须在二级生物安全柜内进行。丢弃前，需用消毒剂处理残留血液制品至少15分钟以使其失活。本实验所用血液来自健康志愿者。本体外巨噬细胞分化方案设定为每名供体每孔接种10 × 10⁶个分离的外周血单个核细胞（PBMCs）。每名供体的一管血沉棕黄层（buffy coat）通常含有约50 mL浓缩白细胞悬液，来源于全血，一般可获得500–800 × 10⁶个PBMCs，其中约10%（即50–80 × 10⁶个）为单核细胞。

1. 在50 mL离心管中，将15 mL的血沉棕黄层（buffy-coat）血液小心加至已准备好的15 mL密度梯度介质上方。将移液管管尖靠在管壁，缓慢将血液叠加在密度梯度层之上。
2. 在室温（RT）下以600 x g离心25分钟，加速度和减速度均设为0。
   注意：离心前应仔细盖紧管盖，每次离心后均需检查离心管套管是否有溢出。
3. 使用无菌巴斯德移液管移除上层血浆层，随后用无菌巴斯德移液管小心收集单个核细胞层至新的50 mL离心管中。向PBMC沉淀中加入无血清RPMI培养基，调整终体积至50 mL。轻轻颠倒混匀数次后，在室温下以500 x g离心5分钟。
4. 小心弃去上清液，通过手指轻弹管底重悬细胞沉淀。
5. 为去除PBMC中的密度梯度介质残留，使用无血清RPMI培养基洗涤细胞2–3次，每次终体积为50 mL。在室温下以500 x g离心5分钟。重复洗涤直至上清液变得透明。
6. 弃去上清液，将细胞重悬于20 mL无血清RPMI培养基中。
7. 通过台盼蓝染色法，使用血细胞计数板手动计数或使用自动细胞计数仪进行细胞计数。将细胞悬液与台盼蓝按1:2或1:10比例稀释，例如在96孔板中混合50 µL细胞悬液与50 µL台盼蓝（用于血细胞计数板计数），或10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝（用于自动细胞计数），计数后计算每毫升活细胞数量。
   注意：台盼蓝具有毒性，必须作为化学废弃物单独处理。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
淋巴细胞分离液（Lymphoprep）	Alere Technologies AS	11508545
RPMI 1640 培养基	Life Technologies Corporation	SH30096.01
EDTA (0.5 M)	卡罗林斯卡大学医院，胡丁厄	N/A
丙酮酸钠（Na-pyruvate）	GE Healthcare Life Sciences	SH300239.01
L-谷氨酰胺（L-Glutamine）	GE Healthcare Life Sciences	SH30034.01
HEPES 缓冲液	GE Healthcare Life Sciences	SH30237.01
胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）	Sigma-Aldrich	F7524