单核细胞来源细胞向类巨噬细胞的分化与极化

摘要

来源：Mily, A., 等. 人源单核细胞来源的M1与M2型极化及流式细胞术分析 结核分枝杆菌 感染。 视频实验杂志 (2020).

在本视频中，我们演示了一种诱导外周血来源的单核细胞分化并极化为M1或M2型巨噬细胞的方法。使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、脂多糖和干扰素-γ孵育可获得促炎性的M1型巨噬细胞，而使用巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4孵育则可诱导产生抗炎性的M2型巨噬细胞。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 单核细胞来源细胞的分化与极化

1. 利用塑料培养皿的贴壁特性分离单核细胞。简言之，将 freshly isolated 外周血单个核细胞（PBMCs）以适当浓度接种于6孔板中，例如每孔2 mL无血清RPMI培养基中加入10 × 10⁶ 个PBMCs（RPMI 1640培养基补充1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺和10 mM HEPES），于37 °C、5% CO₂条件下培养。
2. 培养2–3小时后，用移液器移除非贴壁细胞，并用1 mL无血清培养基洗涤孔板3次。贴壁细胞即为单核细胞，约占接种至每孔的总PBMCs的10%，即每孔加入10 × 10⁶ 个PBMCs可获得约10⁶ 个单核细胞。
3. 为诱导巨噬细胞分化，分别配制含50 ng/mL GM-CSF（用于M1极化）或M-CSF（用于M2极化）的工作液，每孔加入2 mL完全RPMI培养基。将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中培养3天。
4. 第3天时，小心从每孔上层移除1 mL培养基，并向每孔补充1 mL含有双倍浓度M-CSF或GM-CSF的新鲜完全RPMI培养基，使孔中最终浓度为50 ng/mL。生长因子应以预先配制的100 ng/mL/孔工作液形式添加。
5. 第6天时，在细胞分化的最后18–20小时加入不同刺激物，以获得完全极化且成熟的M1型（干扰素-γ；IFN-γ，和脂多糖；LPS（大肠杆菌O55:B5））或M2型（白细胞介素4；IL-4）巨噬细胞。对于M1极化，将IFN-γ和LPS溶于完全RPMI培养基（RPMI 1640培养基补充1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、10 mM HEPES和10%热灭活胎牛血清（FBS）），每孔加入50 µL，使细胞培养物中IFN-γ终浓度为50 ng/mL，LPS终浓度为10 ng/mL。对于M2极化，将IL-4溶于完全RPMI培养基，每孔加入50 µL，使细胞培养物中IL-4终浓度为20 ng/mL。
6. 为获得M0极化巨噬细胞，仅使用M-CSF刺激细胞，不添加其他细胞因子（呈现类似M2的表型）。
7. 定期使用光学显微镜观察单核细胞来源的细胞培养物形态，确保较小的单核细胞已分化为较大的巨噬细胞样细胞。同时监测M1与M2极化细胞之间可能存在的形态学差异，例如M1细胞呈伸长和拉伸状，而M2细胞则更趋于圆形。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
康宁6孔平底培养板	Corning Life Sciences	353046
GM-CSF	Peprotech	300-03
IFN-γ	Peprotech	300-02
IL-4	Peprotech	200-04
L-谷氨酰胺	GE Healthcare Life Sciences	SH30034.01
M-CSF	Peprotech	300-25
RPMI 1640	Life Technologies Corporation	SH30096.01
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	GE Healthcare Life Sciences	SH30237.01
LPS（Escherichia coli O55:B5）	Sigma-Aldrich	L6529
丙酮酸钠	GE Healthcare Life Sciences	SH300239.01