从共同淋巴样前体细胞体外生成浆细胞样树突状细胞

摘要

来源：Chang, S., 等. 体外 利用AC-6饲养系统由共同淋巴样前体细胞生成小鼠浆细胞样树突状细胞 J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了一种 体外 从常见淋巴样祖细胞（CLPs）生成浆细胞样树突状细胞（pDCs）的检测方法。将纯化的CLPs与经γ射线照射的饲养细胞在Fms样酪氨酸激酶-3配体（FL）存在下共培养，CLPs可分化为非贴壁性pDCs，其存在可通过流式细胞术确认。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. AC-6 饲养层细胞的制备

注意：AC-6.21（简称 AC-6）基质细胞系（由斯坦福大学 I. Weissman 提供）应培养于添加了15%热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中。为用作饲养层细胞，AC-6细胞需在共培养前一天接受3,000 rad（30 Gy）的γ射线照射，以阻止其增殖。需注意，若在传代培养过程中细胞密度过高，或传代次数超过20代，AC-6细胞支持分化的功能容易丧失。

1. 用 1 ml 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤 AC-6 细胞一次，并通过抽吸去除 DPBS。加入 0.8 ml 胰蛋白酶溶液（含 0.05% 胰蛋白酶和 0.5 mM EDTA 的 DPBS 溶液），在 37^oC、5% CO₂ 条件下处理 3–5 分钟，随后用 10 倍体积的培养基稀释以终止反应，制备成单细胞悬液。
2. 将 AC-6 细胞以每孔 5.9×10⁴ 个细胞的密度接种至 12 孔板中，在 37^oC、5% CO₂ 条件下过夜培养。
   注意：AC-6 细胞的密度非常关键，较....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 Ly6g/Ly6c (PE)，克隆 RB6-8C5	Biolegend	108408	谱系标记
抗小鼠 NK1.1 (PE)，克隆 PK136	Biolegend	108708	谱系标记
抗小鼠 CD11b (PE)，克隆 M1/70	Biolegend	101208	谱系标记
抗小鼠 CD19 (PE)，克隆 eBio1D3	Biolegend	115508	谱系标记
抗小鼠 B220 (PE)，克隆 RA3-6B2	Biolegend	103208	谱系标记/FACS
抗小鼠 CD3 (PE)，克隆 17A2	Biolegend	100308	谱系标记
抗小鼠 CD8a (PE)，克隆 53-6.7	Biolegend	100707	谱系标记
抗小鼠 MHC-II (PE)，克隆 NIMR-4	Biolegend	107608	谱系标记
抗小鼠 Ter119 (PE)，克隆 TER-119	Biolegend	116208	谱系标记
抗小鼠 Thy1.1 (PE)，克隆 HIS51	eBioscience	12-0900-83	谱系标记
抗小鼠 M-CSFR (APC)，克隆 AFS98	Biolegend	135510	FACS
抗小鼠 c-Kit (PerCP/Cy5.5)，克隆 2B8	Biolegend	105824	FACS
抗小鼠 Sca-1 (FITC)，克隆 D7	Biolegend	108106	FACS
抗小鼠 IL-7Ra (PE/Cy7)，克隆 A7R34	Biolegend	135014	FACS
抗小鼠 CD11c (PerCP/Cy5.5)，克隆 N418	Biolegend	117328	FACS
抗小鼠 CD11b (FITC)，克隆 M1/70	Biolegend	101206	FACS
FACSAria III	BD Biosciences		细胞分选仪
FACS 分选管	BD Biosciences	352054
FlowJo	FlowJo LLC		流式分析软件