从共同淋巴样前体细胞体外生成浆细胞样树突状细胞

摘要

来源：Chang, S., 等. 体外 利用AC-6饲养系统由共同淋巴样前体细胞生成小鼠浆细胞样树突状细胞 J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了一种 体外 从常见淋巴样祖细胞（CLPs）生成浆细胞样树突状细胞（pDCs）的检测方法。将纯化的CLPs与经γ射线照射的饲养细胞在Fms样酪氨酸激酶-3配体（FL）存在下共培养，CLPs可分化为非贴壁性pDCs，其存在可通过流式细胞术确认。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. AC-6 饲养层细胞的制备

注意：AC-6.21（简称 AC-6）基质细胞系（由斯坦福大学 I. Weissman 提供）应培养于添加了15%热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中。为用作饲养层细胞，AC-6细胞需在共培养前一天接受3,000 rad（30 Gy）的γ射线照射，以阻止其增殖。需注意，若在传代培养过程中细胞密度过高，或传代次数超过20代，AC-6细胞支持分化的功能容易丧失。

1. 用 1 ml 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤 AC-6 细胞一次，并通过抽吸去除 DPBS。加入 0.8 ml 胰蛋白酶溶液（含 0.05% 胰蛋白酶和 0.5 mM EDTA 的 DPBS 溶液），在 37^oC、5% CO₂ 条件下处理 3–5 分钟，随后用 10 倍体积的培养基稀释以终止反应，制备成单细胞悬液。
2. 将 AC-6 细胞以每孔 5.9×10⁴ 个细胞的密度接种至 12 孔板中，在 37^oC、5% CO₂ 条件下过夜培养。
   注意：AC-6 细胞的密度非常关键，较低的密度有利于 cDC 的生成。以每孔 5.9×10⁴ 个细胞的密度接种，可使 AC-6 细胞在次日达到汇合状态，此状态最有利于从 CLP 细胞诱导生成 pDC。
3. 使用 γ 射线辐照仪对 AC-6 细胞进行 3,000 rad（30 Gy）的辐照。
   注意：所用辐照剂量经过优化，旨在阻止细胞增殖，同时保持细胞足够长的存活时间，以提供 CLP 向 DC 分化过程中所需的细胞因子和细胞间接触信号。
4. 抽吸培养基，更换为 1 ml 完全 RPMI 培养基（含 10% 热灭活 FBS、50 µg/ml 庆大霉素和 50 µM β-巯基乙醇的 RPMI 培养基）。

2. 从小鼠中分离骨髓细胞

1. 采用 CO₂ 窒息法结合颈椎脱位处死小鼠。将小鼠置于解剖托盘上，并用 70% 乙醇进行表面消毒。在腹部中线处做切口，剥离小鼠远端皮肤，包括覆盖下肢的皮肤。
2. 在半无菌操作台内进行解剖。剪断膝关节上方的股骨和下方的胫骨以分离股骨和胫骨。使用剪刀去除附着在骨上的肌肉组织，将骨骼放入含有 5 ml 完全 RPMI 培养基的 6 cm 培养皿中。
3. 转移至无菌细胞培养超净台。用完全 RPMI 培养基填充一支连接 27G 针头的 3 ml 注射器。用剪刀剪去骨的两端，将 27G 针头插入骨髓腔，从每端各轻柔注入一次完全 RPMI 培养基，以冲洗出骨髓细胞。
4. 取下针头，使用该注射器在培养皿中轻轻吹打细胞 3–5 次，制备单细胞悬液。
5. 以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
6. 加入 1 ml ACK 裂解缓冲液（150 mM NH₄Cl，10 mM KHCO₃，0.1 mM EDTA）裂解红细胞，孵育 1 分钟后，加入 10 倍体积的完全 RPMI 培养基终止反应。静置 5 分钟，使死亡细胞团块和组织碎片在重力作用下沉降形成沉淀。
   注意：静置时间不得超过 5 分钟，否则会导致活细胞因沉降而丢失。
7. 缓慢将含有细胞的上清液转移至新离心管中，保留沉淀物于原管内。
8. 以 500 × g 离心 5 分钟使细胞成团，随后吸除并弃去上清液。
9. 将总骨髓细胞（通常每只小鼠可获得 4–6 × 10⁷ 个骨髓细胞）重悬于 100 µl FACS 缓冲液（1× PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA）中。

3. CLP 的 FACS 分析与分选

1. 在FACS缓冲液（步骤2.9）中的细胞中加入抗CD16/32抗体（杂交瘤上清克隆2.4G2，每反应50 µl或1-2 µg），孵育1-2分钟，以阻断Fc受体。
   注意：抗CD16/32也称为Fc阻断剂，用于防止抗体非特异性结合表达Fc受体的细胞，包括粒细胞、单核细胞和B淋巴细胞。
2. 同时在冰上避光孵育以下荧光染料标记的抗体（针对4×10⁷个细胞）15分钟。抗体包括：PE标记的谱系标志物（每种0.2 µg），即抗CD3（17A2）、抗CD8（53-6.7）、抗B220（RA3-6B2）、抗CD19（eBio1D3）、抗CD11b（M1/70）、抗Gr-1（RB6-8C5）、抗Thy1.1（HIS51）、抗NK1.1（PK136）、抗TER119（TER-119）和抗MHC-II（NIMR-4），0.2 µg抗c-Kit-PerCP-Cy5.5（2B8），1 µg抗Sca-1-FITC（D7），0.4 µg抗M-CSFR-APC（AFS98），以及0.2 µg抗IL-7Rα-PE-Cy7（A7R34）。
3. 用3 ml FACS缓冲液洗涤细胞，并在500 ×g条件下离心5分钟。
4. 将细胞重悬于300 µl FACS缓冲液中，并通过40 µm细胞筛网过滤。
5. 用额外的100 µl FACS缓冲液冲洗离心管，以回收残留细胞，并使用同一细胞筛网过滤至无菌FACS分选管中。
6. 染色后立即使用适当的滤光片和电压进行流式细胞术分析，以检测信号。使用488 nm激光检测FITC和PerCP-Cy5.5标记的抗体，561 nm激光检测PE和PE-Cy7标记的抗体，633 nm激光检测APC标记的抗体。
7. 根据以下表型标记物分选CLPs：lin^-c-kit^intSca-1^intM-CSFR-IL-7Rα⁺（如步骤3.2染色所示），使用细胞分选仪进行分选。将分选出的细胞收集至含有8 ml完全RPMI培养基作为缓冲层的15 ml离心管中。
8. 记录分选结束时细胞分选仪显示的分选细胞绝对数量。通常，可从一只小鼠的骨髓中获得约5×10⁴个CLPs。

4. 共培养 CLP 与 AC-6

1. 将步骤 3.7 中分选的细胞在 500 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，并用足量的完全 RPMI 培养基重悬细胞沉淀，使细胞密度约为 5×10⁴ 个细胞/ml。将 500 个细胞/孔接种至已在步骤 1.4 中制备好饲养细胞的 12 孔板中。
2. 加入 100 ng/ml FL（hu-Flt3L-Ig，由瑞士苏黎世大学医院 M. Manz 提供的表达系统在本实验室制备），在 37^oC、5% CO₂ 条件下培养，并定期在显微镜下观察树突状细胞（DC）的发育情况。
   注意： 可使用市售的重组人 FL 或小鼠 FL 替代 hu-Flt3L-Ig，以支持 DC 的发育。
3. 在第 12 天收集上清液中的细胞，并用 0.5 ml 完全 RPMI 培养基洗涤各孔一次，合并所得上清液。加入 0.5 ml 新鲜培养基，使用细胞刮刀刮下贴壁细胞。
4. 合并来自两部分的含细胞培养基，在 500 × g 条件下离心 5 分钟。
5. 倾去上清液，将细胞重悬于 50 µl FACS 缓冲液中。加入 50 µl 抗-CD16/32 杂交瘤上清液，孵育 1–2 分钟以阻断 Fc 受体。
6. 使用以下抗体（每种 0.05 µg）对所有细胞进行计数并染色：抗-CD11c-APC（N418）、抗-CD11b-FITC 和抗-B220-PE。
7. 按照步骤 3.3 所述方法洗涤并离心细胞。
8. 将细胞重悬于 100 µl FACS 缓冲液中，圈选 CD11c+ 细胞，并分析 cDCs（CD11c⁺CD11b⁺B220^-）和 pDCs（CD11c⁺CD11b^-B220⁺）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 Ly6g/Ly6c (PE)，克隆 RB6-8C5	Biolegend	108408	谱系标记
抗小鼠 NK1.1 (PE)，克隆 PK136	Biolegend	108708	谱系标记
抗小鼠 CD11b (PE)，克隆 M1/70	Biolegend	101208	谱系标记
抗小鼠 CD19 (PE)，克隆 eBio1D3	Biolegend	115508	谱系标记
抗小鼠 B220 (PE)，克隆 RA3-6B2	Biolegend	103208	谱系标记/FACS
抗小鼠 CD3 (PE)，克隆 17A2	Biolegend	100308	谱系标记
抗小鼠 CD8a (PE)，克隆 53-6.7	Biolegend	100707	谱系标记
抗小鼠 MHC-II (PE)，克隆 NIMR-4	Biolegend	107608	谱系标记
抗小鼠 Ter119 (PE)，克隆 TER-119	Biolegend	116208	谱系标记
抗小鼠 Thy1.1 (PE)，克隆 HIS51	eBioscience	12-0900-83	谱系标记
抗小鼠 M-CSFR (APC)，克隆 AFS98	Biolegend	135510	FACS
抗小鼠 c-Kit (PerCP/Cy5.5)，克隆 2B8	Biolegend	105824	FACS
抗小鼠 Sca-1 (FITC)，克隆 D7	Biolegend	108106	FACS
抗小鼠 IL-7Ra (PE/Cy7)，克隆 A7R34	Biolegend	135014	FACS
抗小鼠 CD11c (PerCP/Cy5.5)，克隆 N418	Biolegend	117328	FACS
抗小鼠 CD11b (FITC)，克隆 M1/70	Biolegend	101206	FACS
FACSAria III	BD Biosciences		细胞分选仪
FACS 分选管	BD Biosciences	352054
FlowJo	FlowJo LLC		流式分析软件