从单核细胞生成未成熟、成熟及耐受性树突状细胞

摘要

来源：Sim, W. J. 等，具有不同代谢表型的未成熟、成熟和耐受性树突状细胞的制备 J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了如何从人单核细胞诱导生成未成熟、成熟及耐受性树突状细胞（DC）。通过将单核细胞与生长因子和细胞因子共同孵育，可获得未成熟DC。在免疫调节分子的作用下，未成熟DC可进一步分化为耐受性DC和成熟DC。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离 

1. 试剂的制备
   1. 配制 PBS/EDTA：将磷酸盐缓冲液（PBS）补充 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）。通过 0.2 µm 滤膜过滤对该溶液进行灭菌。注意：将 PBS/EDTA 储存于 4 °C，使用前恢复至室温。
   2. 配制染色缓冲液：将磷酸盐缓冲液（PBS）补充 2% 胎牛血清（FBS）、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）。通过 0.2 µm 滤膜过滤对该溶液进行灭菌。
2. 从血锥中收集血液
   注意： 血锥是医院在血小板单采术后收集的含有白细胞成分的血液。若血液采集于肝素或 EDTA 管中，请以 1:1 比例用 PBS 稀释后进入步骤 1.3；若收到的是白细胞层（buffy coat），请以 1:2 比例用 PBS 稀释后进入步骤 1.3。
   1. 剪开血锥两端，使血液流入 50 ml 离心管中。
      注意血锥通常含有 10 ml 血液。
   2. 使用装有 30 ml PBS/EDTA 的钝头注射....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03	PBMC 分离
注射器	Becton, Dickinson	302832	PBMC 分离
1.5 mL 离心管	Axygen	MCT-150-C	PBMC 分离
15 mL Falcon 管	Falcon	352096	PBMC 分离
50 mL Falcon 管	Falcon	352070	PBMC 分离
离心机	Eppendorf	5810R	PBMC 分离
0.2 µm 滤器	Sartorius stedim biotech	17597	PBMC 分离
MACs 试剂盒	Miltenyi biotec	130-042-201	单核细胞富集
MiniMACS 分离器	Miltenyi biotec	130-042-102	单核细胞富集
细胞培养级水	Invitrogen, Life Technologies		细胞培养
RPMI	Gibco, Life Technologies	11875-093	细胞培养
FBS	Hyclone	SH30070103	细胞培养
青霉素-链霉素	Gibco, Life Technologies	15140	细胞培养
磷酸盐缓冲液	Gibco, Life Technologies	10010-031	细胞培养
非必需氨基酸（NEAA）	Gibco, Life Technologies	11140-040	细胞培养
EDTA	Gibco, Life Technologies	15575	细胞培养
HEPES	Gibco, Life Technologies	15630-080	细胞培养
丙酮酸钠	Gibco, Life Technologies	11360-070	细胞培养
GM-CSF	Miltenyi biotec	130-093-868	细胞培养
IL-4	Miltenyi biotec	130-093-924	细胞培养
维生素 D3	Sigma	D1530	细胞培养
地塞米松	Sigma	D2915	细胞培养
LPS	Sigma	l2755	细胞培养
台盼蓝	Gibco, Life Technologies	15250-061	细胞培养