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从单核细胞生成未成熟、成熟及耐受性树突状细胞

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2025年7月8日

本文内容

摘要

来源：Sim, W. J. 等，具有不同代谢表型的未成熟、成熟和耐受性树突状细胞的制备 J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了如何从人单核细胞诱导生成未成熟、成熟及耐受性树突状细胞（DC）。通过将单核细胞与生长因子和细胞因子共同孵育，可获得未成熟DC。在免疫调节分子的作用下，未成熟DC可进一步分化为耐受性DC和成熟DC。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离 

  1. 试剂的制备
    1. 配制 PBS/EDTA：将磷酸盐缓冲液（PBS）补充 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）。通过 0.2 µm 滤膜过滤对该溶液进行灭菌。注意：将 PBS/EDTA 储存于 4 °C，使用前恢复至室温。
    2. 配制染色缓冲液：将磷酸盐缓冲液（PBS）补充 2% 胎牛血清（FBS）、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）。通过 0.2 µm 滤膜过滤对该溶液进行灭菌。
  2. 从血锥中收集血液
    注意： 血锥是医院在血小板单采术后收集的含有白细胞成分的血液。若血液采集于肝素或 EDTA 管中，请以 1:1 比例用 PBS 稀释后进入步骤 1.3；若收到的是白细胞层（buffy coat），请以 1:2 比例用 PBS 稀释后进入步骤 1.3。
    1. 剪开血锥两端，使血液流入 50 ml 离心管中。
      注意血锥通常含有 10 ml 血液。
    2. 使用装有 30 ml PBS/EDTA 的钝头注射器冲洗血锥，并将冲洗液收集至 50 ml 离心管中。
    3. 用 PBS/EDTA 进一步稀释血液，最终体积为 80 ml。
  3. 通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）
    1. 将 15 ml Ficoll 分装至 4 个新的 50 ml 离心管中。
    2. 使用 25 ml 血清移液管将 20 ml 稀释后的血液缓慢加至 Ficoll 液面上方。注意将 50 ml 管倾斜约 45° 角，并小心避免扰动两相界面。
    3. 在 20 °C 条件下，以 805 × g 离心 30 分钟，离心过程中不启用刹车。
    4. 移除血浆层，并用巴斯德移液管收集位于血浆层下方的 PBMC 环状层。将四管 PBMC 合并至两个 50 ml 离心管中。注意避免收集 PBMC 下方的透明层。
    5. 每管 PBMC 加入 PBS/EDTA 至终体积为 50 ml，然后在 20 °C 条件下，以 548 × g 离心 10 分钟，启用刹车。
    6. 吸除上清液，每管沉淀用 25 ml 染色缓冲液重悬，再合并至一个 50 ml 离心管中。
    7. 在 4 °C 条件下，以 367 × g 离心 5 分钟，启用刹车。
    8. 吸除上清液，用 10 ml 染色缓冲液重悬沉淀。

2. 通过磁性分离法富集单核细胞

  1. 确定细胞数量
    1. 取 20 µl PBMC 细胞悬液，与 20 µl 台盼蓝混合，使用细胞计数仪计数活细胞数量。
    2. 将细胞悬液在 4 °C 条件下，以 367 x g 离心 10 分钟，使用刹车。
    3. 完全吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 80 µl 染色缓冲液中，使细胞浓度为 107 个细胞。
  2. 磁性标记
    1. 每 107 个细胞加入 20 µl CD14 微珠，充分混匀，在 2 - 8 °C 条件下孵育 15 分钟。
    2. 每 107 个细胞加入 1 ml 染色缓冲液洗涤细胞，然后在 4 °C 条件下，以 367 x g 离心 10 分钟，使用刹车。
    3. 完全吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 50 µl 染色缓冲液中，使细胞浓度为 107 个细胞。
  3. 磁性分离
    1. 对于最多 2 x 108 个总细胞，使用中等尺寸的分选柱。
      注意：根据产品说明书推荐的总细胞数和 CD14+ 细胞数，选择合适的分选柱和磁性分离器。
    2. 将分选柱置于合适的磁性分离器的磁场中，并用 500 µl 染色缓冲液冲洗分选柱以进行预处理。
    3. 将细胞悬液用移液器加至分选柱上，用 15 ml 离心管收集未标记的流穿细胞。
    4. 在分选柱下方更换新的 15 ml 离心管，并用 500 µl 染色缓冲液洗涤分选柱 3 次。每次洗涤前确保分选柱储液腔已完全排空，再加入下一份染色缓冲液。
    5. 将分选柱从磁性分离器上取下，放置于一个新的 15 ml 离心管上。
    6. 向分选柱中加入 1 ml 染色缓冲液。立即使用试剂盒中提供的推杆用力插入分选柱，将磁性标记的细胞快速冲洗出来。
    7. 使用洗脱组分在新的分选柱上重复步骤 2.3.2 至 2.3.6，以提高 CD14+ 细胞的纯度。注意在步骤 3.2 的培养过程中，微珠会自动从细胞上解离。

3. 树突状细胞向不同活化状态的分化 

  1. 试剂制备（所有试剂的内毒素水平必须低于 0.1 EU/ml）
    1. 制备细胞培养基：RPMI 1640 培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 非必需氨基酸（NEAA）和 0.05 mM 2-巯基乙醇（2ME）。通过 0.2 µm 滤膜过滤对该溶液进行灭菌。
    2. 制备细胞因子：在无菌条件下，分别用细胞培养级水将 IL-4 和 GM-CSF 重悬至浓度为 0.25 mg/ml。将细胞因子分装至 200 µl 微量离心管中，并于 -80 °C 保存。
    3. 制备维生素 D3 储存液：在无菌条件下，用细胞培养级水将维生素 D3 重悬至浓度为 100 mM。将维生素 D3 分装至 1.5 ml 微量离心管中，并于 -20 °C 保存。
    4. 制备地塞米松储存液：在无菌条件下，用细胞培养级水将地塞米松重悬至浓度为 10 mM。将地塞米松分装至 1.5 ml 微量离心管中，并于 -20 °C 保存。
    5. 制备 LPS：在无菌条件下，用细胞培养级水将脂多糖（LPS）重悬至浓度为 1 mg/ml。将 LPS 分装至 1.5 ml 微量离心管中，并于 -20 °C 保存。
  2. 生成不同类型的 moDCs
    1. 将四组 CD14+ 单核细胞以 0.3 - 0.5 x 106/ml 的密度接种于 6 孔板中，每孔培养基体积为 2 ml，培养基中添加 200 ng/ml GM-CSF 和 200 ng/ml IL-4。注意，此为第 0 天。
    2. 将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的组织培养箱中孵育。
    3. 在第 4 天，从培养物中移除 850 µl 培养基，于 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 1 ml 含有 2 倍浓度（200 ng/ml GM-CSF 和 200 ng/ml IL-4）的细胞培养基中，然后将该细胞悬液加回原培养孔中。注意，加入的 GM-CSF 和 IL-4 为 2 倍浓度，当 1 ml 培养基加回后，其终浓度即为 1 倍。
    4. 在第 5 天，向其中两组培养物中每毫升培养基加入 1 µl 维生素 D3 储存液和 1 µl 地塞米松储存液，以生成耐受性 moDCs。注意，维生素 D3 的终浓度为 100 nM，地塞米松的终浓度为 10 nM；第 5 天无需添加 GM-CSF 和 IL-4。
    5. 在第 6 天，向所有组别中添加 200 ng/ml GM-CSF 和 200 ng/ml IL-4。
    6. 在第 6 天，向仅用 GM-CSF 和 IL-4 处理的一组中加入 1 µg/ml LPS，以生成成熟 moDCs。
    7. 在第 6 天，向一组耐受性 moDCs 中加入 1 µg/ml LPS，以生成 LPS 耐受性 moDCs。
    8. 在第 7 天，通过 PBS 加 EDTA 冲洗培养皿收集不同类型 moDCs，用于流式细胞术或其他研究。注意，仅收集非贴壁细胞。需注意，由 CD14+ 单核细胞生成的未成熟 moDCs、成熟 moDCs、耐受性 moDCs 和 LPS 耐受性 DCs 的得率分别约为 90%、50%、60% 和 60%，且因供血者和 FBS 批次不同而有所差异。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
FicollGE Healthcare17-1440-03PBMC 分离
注射器Becton, Dickinson302832PBMC 分离
1.5 mL 离心管AxygenMCT-150-CPBMC 分离
15 mL Falcon 管Falcon352096PBMC 分离
50 mL Falcon 管Falcon352070PBMC 分离
离心机Eppendorf5810RPBMC 分离
0.2 µm 滤器Sartorius stedim biotech17597PBMC 分离
MACs 试剂盒Miltenyi biotec130-042-201单核细胞富集
MiniMACS 分离器Miltenyi biotec130-042-102单核细胞富集
细胞培养级水Invitrogen, Life Technologies细胞培养
RPMIGibco, Life Technologies11875-093细胞培养
FBSHycloneSH30070103细胞培养
青霉素-链霉素Gibco, Life Technologies15140细胞培养
磷酸盐缓冲液Gibco, Life Technologies10010-031细胞培养
非必需氨基酸（NEAA）Gibco, Life Technologies11140-040细胞培养
EDTAGibco, Life Technologies15575细胞培养
HEPESGibco, Life Technologies15630-080细胞培养
丙酮酸钠Gibco, Life Technologies11360-070细胞培养
GM-CSFMiltenyi biotec130-093-868细胞培养
IL-4Miltenyi biotec130-093-924细胞培养
维生素 D3SigmaD1530细胞培养
地塞米松SigmaD2915细胞培养
LPSSigmal2755细胞培养
台盼蓝Gibco, Life Technologies15250-061细胞培养

标签

单核细胞分化未成熟树突状细胞成熟树突状细胞耐受性树突状细胞维生素D3处理LPS刺激流式细胞术MHC II类分子CD80 CD86
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