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方法文章

从人外周血中分离和纯化B细胞

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2025年7月8日

本文内容

摘要

来源:Tzeng, S. J. 从血液中分离、分化和定量人源抗体分泌型B细胞:ELISpot作为体液免疫的功能性检测方法。J. Vis. Exp. (2016)

在本视频中,我们展示了使用针对非B细胞的生物素化抗体以及链霉亲和素偶联的磁性微珠,从人外周血中分离B细胞的方法。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行,并已通过当地机构审查委员会的审查

1. 人外周血B细胞的分离与纯化

  1. 使用含K2EDTA(1.5至2.0 mg/mL血液)的15 mL离心管,从肘前窝的肘正中静脉抽取约10 mL血液,并立即反复倒置离心管数次,以防止凝血形成。
  2. 向含有新鲜血液样本的离心管中加入35 mL经高压灭菌(121 °C,15分钟)的红细胞(RBC)裂解缓冲液(150 mM NH4Cl、10 mM KHCO3和1 mM EDTA;pH 7.4)(体积比≥3:1),并在室温(RT)孵育不超过5分钟。
    注意:当可见光线透过离心管时,表明红细胞裂解已完成。
  3. 在室温下以600 × g离心5分钟。确保沉淀呈白色。
  4. 用10 mL经高压灭菌的磷酸盐缓冲液(PBS,137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4和1.47 mM KH2PO4;pH 7.4)重悬沉淀,并按步骤1.3进行离心。
  5. 弃去上清液,用10 mL RPMI 1640培养基(添加物:10%胎牛血清、100 U/....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD Vacutainer K2EBD Biosciences36752510 ml 管
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-02无内毒素
0.5% 台盼蓝溶液Biological Industries03-102-1B染料
IMag 人 B 淋巴细胞富集试剂盒BD Biosciences558007试剂
链霉亲和素磁性微珠BD Biosciences9000810试剂
15 ml Falcon 管BD Falcon352196塑料器皿
生物素化 CD27 单克隆抗体Biolegend302804克隆株 O323
生物素化抗人 CD27Biolegend302804克隆株 O323
生物素化抗人 CD27eBioscience13-0279-80克隆株 O323

标签

B细胞分离免疫磁珠分离红细胞裂解生物素化抗体链霉亲和素磁珠阴性筛选细胞培养贴壁磁性分离流式细胞术