从人外周血中分离和纯化B细胞

摘要

来源：Tzeng, S. J. 从血液中分离、分化和定量人源抗体分泌型B细胞：ELISpot作为体液免疫的功能性检测方法。J. Vis. Exp. (2016)

在本视频中，我们展示了使用针对非B细胞的生物素化抗体以及链霉亲和素偶联的磁性微珠，从人外周血中分离B细胞的方法。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查

1. 人外周血B细胞的分离与纯化

1. 使用含K₂EDTA（1.5至2.0 mg/mL血液）的15 mL离心管，从肘前窝的肘正中静脉抽取约10 mL血液，并立即反复倒置离心管数次，以防止凝血形成。
2. 向含有新鲜血液样本的离心管中加入35 mL经高压灭菌（121 °C，15分钟）的红细胞（RBC）裂解缓冲液（150 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃和1 mM EDTA；pH 7.4）（体积比≥3:1），并在室温（RT）孵育不超过5分钟。
   注意：当可见光线透过离心管时，表明红细胞裂解已完成。
3. 在室温下以600 × g离心5分钟。确保沉淀呈白色。
4. 用10 mL经高压灭菌的磷酸盐缓冲液（PBS，137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na₂HPO₄和1.47 mM KH₂PO₄；pH 7.4）重悬沉淀，并按步骤1.3进行离心。
5. 弃去上清液，用10 mL RPMI 1640培养基（添加物：10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B和2 mM L-谷氨酰胺）重悬沉淀，然后将细胞接种至10 cm培养皿中（每皿10 mL血液）。将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育30分钟。
6. 轻轻摇晃培养皿数次，将培养基（悬浮细胞）转移至15 mL塑料锥形离心管中。弃去培养皿上贴壁的细胞（主要为巨噬细胞）。
7. 在室温下以600 × g离心5分钟。弃去上清液。
8. 用1 mL RPMI 1640培养基重悬沉淀，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞数。
   注意：通过台盼蓝排斥法检测，分离得到的白细胞活力通常高于90%。
9. 按步骤1.7进行离心，然后用约200 µL冷PBS缓冲液（含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA）重悬细胞，细胞浓度为5 - 10 × 10⁶个/mL。
10. 每10⁶个细胞加入5 µL针对血细胞的生物素标记抗人抗体混合物（用于B细胞的阴性筛选），冰上孵育30分钟。
    注意：抗人抗体混合物应至少包含针对CD2（或CD3）、CD14和CD16的特异性抗体。
11. 向细胞中加入10倍体积的无菌PBS，以600 × g离心5分钟，弃去上清液。
12. 向沉淀中加入等量的链霉亲和素偶联微珠（每10⁶个细胞加5 µL），充分混匀。
13. 在15 mL塑料锥形离心管中冰上孵育30分钟。
14. 向离心管中加入2 mL PBS缓冲液。
15. 将离心管放入磁力架中，室温孵育8分钟。棕色微珠将逐渐附着在靠近磁铁的管壁上。
16. 保持离心管在磁力架中，小心地将上清液转移至新的无菌15 mL离心管中。
17. 重复步骤1.14至1.16，并合并两次所得的上清液（其中含有未接触的B细胞）。弃去微珠。
18. 在室温下以600 × g离心5分钟。弃去上清液。
19. 用RPMI 1640培养基重悬沉淀，用于后续实验。
    注意：通常可从10 mL外周血中分离得到1 - 5 × 10⁵个纯度高于95%的B细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	10 ml 管
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	无内毒素
0.5% 台盼蓝溶液	Biological Industries	03-102-1B	染料
IMag 人 B 淋巴细胞富集试剂盒	BD Biosciences	558007	试剂
链霉亲和素磁性微珠	BD Biosciences	9000810	试剂
15 ml Falcon 管	BD Falcon	352196	塑料器皿
生物素化 CD27 单克隆抗体	Biolegend	302804	克隆株 O323
生物素化抗人 CD27	Biolegend	302804	克隆株 O323
生物素化抗人 CD27	eBioscience	13-0279-80	克隆株 O323