基于流式细胞术的细胞分选，适用于不同的循环 B 细胞群

Abstract

来源:Tzeng， SJ 血液中人类抗体分泌 B 细胞的分离、分化和定量:ELISpot 作为体液免疫的功能读数。J. Vis. Exp. （2016 年）。

在本视频中，我们描述了一种基于流式细胞术对人外周血 B 细胞中的幼稚 B 细胞、记忆 B 细胞和浆母细胞浆细胞亚群进行分选的方案。根据基于荧光团的抗体与 B 细胞表面表达的 CD19、CD27 和 CD38 受体的结合，然后进行细胞分选，来区分不同的 B 细胞亚群。

Protocol

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利指南执行，并已由当地机构审查委员会审查。

1. 用于收集初始 B 细胞、记忆 B 细胞和浆母细胞/浆细胞 （PBs/PC） 的细胞分选

1. 使用纯化的人外周血 B 细胞，使用血细胞计数器或自动细胞计数仪确定细胞数量。
在
2. 5 mL 聚苯乙烯管中以 10⁷/mL 的浓度将细胞重悬于冷 PBS 缓冲液中。
3. 每 10⁶ 个细胞加入 1 - 2 μg 人 IgG，并在冰上孵育 10 分钟以获得 Fc 模块。
4. 每 10⁶ 个细胞加入 1 μg 抗 CD19-APC（克隆:HIB19）、抗 CD27-eFluor450（克隆:O323）和抗 CD38-PE（克隆:HIT2）;充分混合并在冰上孵育 30 分钟。
5. 在步骤 1.4 的最后 5 分钟内，加入 5 μL 市售 7-氨基放线菌素 D （7-AAD）。
6. 向试管中加入 2 mL PBS，涡旋，并以 600 x g 离心 5 分钟。
7. 在 15 mL 试管中以 1 - 5 x 10⁷ 个细胞/mL 的浓度分选缓冲液（含 2% BSA 和 2 mM EDTA 的无菌 PBS）重悬细胞。
8. 通过尼龙网状细胞过滤器（40 μm 孔径）过滤细胞以消除细胞团块。
9. 使用配备三种激光器的流式细胞仪分选仪分离细胞:紫色 （405 nm）、蓝色 （488 nm） 和红色 （640 nm><）。 注:单独的蓝色激光就足以进行 3 色流式细胞术。
10. 将细胞分选到三个 15 mL 管中（含有 5 mL RPMI 培养基），以同时收集幼稚 B 细胞 （CD19⁺CD27^-）、记忆 B 细胞 （CD19⁺CD27⁺） 和 PBs/PC （CD19⁺CD27^+/hiCD38⁺）。
    注意:分选的幼稚 B 细胞和记忆 B 细胞可以进一步培养。

Materials