基于流式细胞术的循环B细胞亚群分选

摘要

来源：Tzeng, S. J. 从血液中分离、分化和定量人源抗体分泌型B细胞：ELISpot作为体液免疫的功能性检测方法。J. Vis. Exp. (2016)。

在本视频中，我们介绍一种基于流式细胞术从人外周血B细胞中分选初始B细胞、记忆B细胞以及浆母细胞/浆细胞亚群的实验方案。通过荧光标记抗体与B细胞表面表达的CD19、CD27和CD38受体结合，可区分不同的B细胞亚群，随后进行细胞分选。

方案

所有涉及人类受试者的研究程序均按照机构、国家及国际有关人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核。

1. 初始B细胞、记忆B细胞以及浆母细胞/浆细胞（PBs/PCs）的分选收集

1. 使用纯化的人外周血B细胞，通过血细胞计数板或自动细胞计数仪确定细胞数量。
2. 将细胞重悬于冰冷的PBS缓冲液中，浓度为每毫升10⁷个细胞，置于5 mL聚苯乙烯管中。
3. 每10⁶个细胞加入1–2 µg人IgG，冰上孵育10分钟，进行Fc受体封闭。
4. 每10⁶个细胞加入抗CD19-APC（克隆号：HIB19）、抗CD27-eFluor450（克隆号：O323）和抗CD38-PE（克隆号：HIT2）各1 µg；充分混匀后冰上孵育30分钟。
5. 在步骤1.4的最后5分钟内，每管加入5 µL商用7-氨基放线菌素D（7-AAD）。
6. 向管中加入2 mL PBS，涡旋混匀后以600 × g离心5分钟。
7. 将细胞重悬于分选缓冲液（含2% BSA和2 mM EDTA的无菌PBS）中，浓度为每毫升1–5 × 10⁷个细胞，置于15 mL管中。
8. 通过尼龙网细胞滤器（孔径40 µm）过滤细胞，以去除细胞团块。
9. 使用配备三种激光器（紫色405 nm、蓝色488 nm、红色640 nm）的流式细胞分选仪对细胞进行分选。
   注意：仅使用蓝色激光器即可满足三色流式细胞术的需求。
10. 将细胞分选至三个15 mL试管中（每管含5 mL RPMI培养基），同时收集初始B细胞（CD19⁺CD27^-）、记忆B细胞（CD19⁺CD27⁺）和浆母细胞/浆细胞（CD19⁺CD27^+/hiCD38⁺）。
    注意：分选后的初始B细胞和记忆B细胞可进一步培养。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL Falcon 离心管	BD Falcon	352196
蓝色尼龙筛网细胞滤器，40 μm	BD Falcon	352340
抗人 CD19-APC	Biolegend	302212	克隆株 HIB19
抗人 CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	克隆株 O323
抗人 CD38-PE-Cy7	Biolegend	303516	克隆株 HIT2
抗人 CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	克隆株 HIT2
抗人 CD45-FITC	Biolegend	304006	克隆株 HI30
抗人 CD45-FITC	BD Biosciences	555482	克隆株 HI30
抗小鼠/大鼠/人 CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	克隆株 LG.3A10
抗人 CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	克隆株 L128
抗人 CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	克隆株 LT19
抗人 CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	克隆株 LT19
抗人 CD20-FITC	BD Biosciences	555622	克隆株 2H7
7-氨基放线菌素 D（7-AAD）	BD Biosciences	559925
人 IgG	Jackson ImmunoResearch	009-000-003