利用ELISpot实验对抗体分泌B细胞进行功能评估

摘要

来源：Tzeng, S. J. 从血液中分离、分化和定量人源抗体分泌型B细胞：ELISpot作为体液免疫的功能性检测方法。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了如何使用ELISpot实验评估抗体分泌型B细胞（ASCs）的功能。ASCs分泌的抗体与膜结合的多克隆抗体片段发生相互作用，并由酶标记的IgG或IgM抗体进行检测。每个孔中产生的有色斑点表明特异性抗体同种型的存在，其数量与B细胞的分泌活性相关。

方案

所有涉及人类受试者的研究程序均按照机构、国家及国际有关人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核。

必须在知情同意的前提下从健康供者处采集人外周血，且血液样本的使用须符合评审委员会批准的指导原则。本研究中，使用人血样本的方案用于展示流式细胞术（图1）和ELISpot实验（图2）的结果。

1. 人外周血B细胞的分离与纯化

1. 从肘前窝的肘正中静脉采集约 10 mL 血液至含有 K₂EDTA（1.5 至 2.0 mg/mL 血液）的 15-mL 管中，并立即反复倒置数次，以防止凝血。
2. 向含有新鲜血液样本的管中加入 35 mL 经高压灭菌（121 °C，15 分钟）的红细胞（RBC）裂解缓冲液（150 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃ 和 1 mM EDTA；pH 7.4）（体积比 ≥ 3:1），并在室温（RT）孵育不超过 5 分钟。
   注意： 当可见光线透过管壁时，表明红细胞裂解已完成。
3. 在室温下以 600 × g 离心 5 分钟。确保沉淀呈白色。
4. 用 10 mL 高压灭菌的磷酸盐缓冲液（PBS，137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na₂HPO₄ 和 1.47 mM KH₂PO₄；pH 7.4）重悬沉淀，并按步骤 1.3 的条件进行离心。
5. 弃去上清液，用 10 mL RPMI 1640 培养基（添加物：10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素/链霉素、0.25 µg/mL 两性霉素 B 和 2 mM L-谷氨酰胺）重悬沉淀，然后将细胞接种至 10-cm 培养皿中（每皿 10 mL 血液）。将培养皿置于含 5% CO₂ 的 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。
6. 轻轻摇晃培养皿数次，将培养基（悬浮细胞）转移至 15-mL 塑料锥形管中。弃去培养皿上贴壁的细胞（主要为巨噬细胞）。
7. 在室温下以 600 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。
8. 用 1 mL RPMI 1640 培养基重悬沉淀，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞数量。
   注意： 通过台盼蓝排斥法检测，分离得到的白细胞活力通常高于 90%。
9. 按步骤 1.7 离心后，用约 200 µL 冷 PBS 缓冲液（含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA）重悬细胞，调整细胞浓度至 5 - 10 × 10⁶ 个细胞/mL。
10. 每 10⁶ 个细胞加入 5 µL 针对血液细胞的生物素化抗人抗体混合物（用于 B 细胞的阴性筛选），冰上孵育 30 分钟。
    注意： 抗人抗体混合物应至少包含针对 CD2（或 CD3）、CD14 和 CD16 的特异性抗体。
11. 向细胞中加入 10 倍体积的无菌 PBS，以 600 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
12. 向沉淀中加入等量的链霉亲和素偶联微珠（每 10⁶ 个细胞加 5 µL），充分混匀。
13. 在冰上孵育 30 分钟，使用 15-mL 塑料锥形管。
14. 向管中加入 2 mL PBS 缓冲液。
15. 将管放入磁力架中，在室温下孵育 8 分钟。棕色微珠将逐渐附着在靠近磁铁的管壁上。
16. 保持管子在磁力架中，小心地将上清液转移至新的无菌 15-mL 管中。
17. 重复步骤 1.14 至 1.16，合并两次所得的上清液（其中含有未接触的 B 细胞）。弃去微珠。
18. 在室温下以 600 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。
19. 用 RPMI 1640 培养基重悬沉淀，用于后续实验。
    注意： 通常可从 10 mL 外周血中分离得到 1 - 5 × 10⁵ 个纯度高于 95% 的 B 细胞。

2. 从分离的B细胞中纯化与分离记忆B细胞和初始B细胞

1. 使用步骤1中纯化的细胞，通过血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞数量。
2. 离心后，用 100 µL 冷 PBS 缓冲液重悬细胞 g 以及室温孵育5分钟。
3. 每10加入1 - 2 µg生物素标记的CD27单克隆抗体⁶ 细胞并在冰上孵育30分钟。
4. 加入10 mL PBS缓冲液至离心管中，于600 x g 5 分钟。
5. 弃去上清液，将细胞重悬于50 µL PBS缓冲液中。
6. 加入等量的链霉亲和素磁珠（1 - 2 µg/10⁶ 细胞）转移至一个15 mL塑料锥形管中。
7. 轻轻混匀，冰上孵育30分钟。
8. 向试管中加入 2 - 3 mL PBS 缓冲液。
9. 将试管放入磁力架中，室温孵育8分钟，使棕色微珠吸附在靠近磁铁一侧的管壁上。
10. 将试管置于磁力架上，小心地将上清液转移至新的无菌试管中。该上清液含有富集的CD27^- 初始B细胞
11. 向含有微珠的试管中加入 5 mL 溶液，轻轻重悬微珠（即， CD27富集组分⁺ 记忆B细胞
12. 以 600 x g 离心 g 室温孵育5分钟。用RPMI 1640培养基重悬沉淀，用于后续实验。
    注意： 通常，约 30 - 60% 的 B 细胞可被纯化为 CD27⁺ 健康供体外周血单个核细胞（PBMCs）中的记忆细胞。

3. 初始B细胞、记忆B细胞及浆母细胞/浆细胞的分选收集

1. 使用步骤1中纯化的细胞，通过血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞数量。
2. 将细胞重悬于冰冷的PBS缓冲液中，浓度为每毫升10⁷个细胞，置于5 mL聚苯乙烯管中。
3. 每10⁶个细胞加入1–2 µg人IgG，冰上孵育10分钟，以进行Fc受体封闭。
4. 每10⁶个细胞分别加入1 µg抗CD19-APC（克隆号：HIB19）、抗CD27-eFluor450（克隆号：O323）和抗CD38-PE（克隆号：HIT2），充分混匀后冰上孵育30分钟。
5. 在步骤3.4的最后5分钟内，每管加入5 µL商用7-氨基放线菌素D（7-AAD）。
6. 向管中加入2 mL PBS，涡旋混匀后以600 × g离心5分钟。
7. 将细胞重悬于分选缓冲液（含2% BSA和2 mM EDTA的无菌PBS）中，浓度为每毫升1–5 × 10⁷个细胞，置于15 mL管中。
8. 通过尼龙网细胞滤器（孔径40 µm）过滤细胞，以去除细胞团块。
9. 使用配备三种激光器（紫色405 nm、蓝色488 nm、红色640 nm）的流式细胞分选仪对细胞进行分选。
   注意：仅使用蓝色激光器即可满足三色流式细胞术的需求。
10. 将细胞分选至三个15 mL试管中（每管含5 mL RPMI培养基），同时收集初始B细胞（CD19⁺CD27^-）、记忆B细胞（CD19⁺CD27⁺）以及浆母细胞/浆细胞（PBs/PCs，CD19⁺CD27^+/hiCD38⁺）。
    注意：分选后的初始B细胞和记忆B细胞可按照步骤4所述进行培养。

4. 体外 分离的人CD19细胞的分化⁺ B细胞，CD19⁺CD27⁺ 记忆B细胞和CD19⁺CD27^- 初始B细胞

1. 使用步骤 1.19、2.10、2.11 和 3.10 中纯化的细胞，用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞数量。
2. 用 RPMI 1640 培养基将细胞重悬，浓度为每毫升 1 - 10 × 10⁵ 个细胞，并分装至 12 孔板的各孔中。
3. 每 10⁶ 个细胞每毫升加入 5 µg 的 CpG（ODN 2006）。
4. 将细胞置于含 5% CO₂ 的 37 °C 培养箱中培养 5 天。
5. 从每个孔中收集细胞，分别放入 15 mL 离心管中，每管加入 5 mL PBS，于室温下以 600 × g 离心 5 分钟。
6. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，然后用 RPMI 1640 培养基将细胞重悬至浓度为每毫升 1 - 10 × 10⁵ 个细胞。

5. ELISpot 实验

1. 向ELISpot板的每个孔中加入30 µL 35%乙醇水溶液，孵育30秒。
   注意： 移液时，务必避免触碰到孔中的膜。
2. 倒置ELISpot板以去除乙醇。
3. 加入150 µL经高压灭菌的ddH₂O₂向每个孔中加入 O，室温孵育 5 分钟以洗去残留的乙醇；随后用无菌 PBS 在室温下洗涤 3 分钟。
   注意： 步骤5.1至5.3可能是可选的，具体取决于平板的生产厂家。
4. 加入50 µL浓度为5 µg/mL的多克隆F(ab')₂ 将抗人Ig（IgG + IgM + IgA）片段（溶于PBS）加入ELISpot板的每孔中，4 °C孵育过夜（推荐）或37 °C孵育2小时。
   注意： 用Parafilm密封板的边缘，直至使用。
5. 倒置培养板以去除未结合的抗体，每孔加入 200 µL PBS，室温下孵育两次，每次 3 分钟。
6. 每孔加入200 µL含5% BSA的PBS（或RPMI 1640培养基）进行封闭，室温孵育2 h。
7. 倒置平板以去除封闭缓冲液。按照步骤5.5的方法，用200 µL PBS洗涤每个孔两次。
8. 向每个孔中加入 100 µL RPMI 1640 培养基，并在 37 °C 下孵育。
9. 准备接种细胞时，将培养板倒置以去除 RPMI 1640 培养基。
10. 接种 100 µL（5 x 10⁴），50 µL（2.5 × 10⁴），以及 25 µL（1.25 × 10⁴将细胞（来自步骤1.19、2.10、2.11、3.10和4.6）加入ELISpot板的孔中。用RPMI 1640培养基将每孔体积补至150 µL。
    注意： 建议至少进行一到两次2倍系列稀释后再接种细胞。
11. 在37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育培养板₂ 孵育8至14小时。孵育期间避免移动培养板。
12. 倒置培养板以去除细胞和RPMI 1640培养基。
13. 每孔加入 200 µL PBS-T（含 0.05% Tween 20 的 PBS），室温孵育，每次 3 分钟，共洗涤 5 次。每次洗涤之间将板倒置以去除洗液。
14. 向指定孔中加入辣根山羊抗人IgG-碱性磷酸酶（AP）Fcγ特异性抗体（用于IgG检测，PBS-T中1:5,000稀释）或辣根山羊抗人IgM-AP Fcµ片段特异性抗体（用于IgM检测，PBS-T中1:5,000稀释），于室温避光孵育2小时。
15. 用 200 µL PBS 洗涤每个孔，重复两次，步骤同 5.5。
16. 每孔加入 50 µL 溴氯靛蓝磷酸盐-硝基蓝四唑（BCIP/NBT）底物溶液。通常在 5 - 15 分钟内出现紫色斑点。
17. 每孔加入 100 µL ddH₂O₂以防止斑点过度发育。
18. 用流动的自来水冲洗平板，直至所有斑点完全显影。
19. 移除平板的底层排水装置，并在避光条件下使其自然风干。
20. 使用配备图像采集/分析单元的自动酶标仪计数斑点例如， 自动扫描仪或手动操作 通过 解剖显微镜）
    注意： 平板可在避光条件下于室温保存，之后再进行分析。

结果

图 1. 外周血单个核细胞（PBMCs）中初始 B 细胞、记忆 B 细胞和浆母细胞（PBs）的设门策略示意图。（A）将细胞（2 × 10⁶）用各 2 µg 的 CD19-APC、CD27-eFluor450 和 CD38-PE 单克隆抗体染色（步骤 3.4）。在前向散射（FSC）对侧向散射（SSC）的散点图中圈选淋巴细胞群（G1）。（B） 在 FSC-W（宽度）对 FSC-H（高度）的图中排除细胞双联体（位于 G2 以外的事件）。（C） 在 SSC-A（面积）对 CD19-APC 的图中，将 CD19⁺ B 细胞设为 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	10 ml 离心管
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	无内毒素
0.5% 台盼蓝溶液	Biological Industries	03-102-1B
IMag 人 B 淋巴细胞富集试剂盒	BD Biosciences	558007
生物素标记 CD27 单克隆抗体	Biolegend	302804	克隆号 O323
链霉亲和素磁性微珠	BD Biosciences	9000810
15 ml Falcon 离心管	BD Falcon	352196
蓝色尼龙网细胞筛，40 μm	BD Falcon	352340
抗人 CD19-APC	Biolegend	302212	克隆号 HIB19
抗人 CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	克隆号 O323
抗人 CD38-PE-Cy7	Biolegend	303516	克隆号 HIT2 
抗人 CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	克隆号 HIT2 
抗人 CD45-FITC	Biolegend	304006	克隆号 HI30
抗人 CD45-FITC	BD Biosciences	555482	克隆号 HI30
抗小鼠/大鼠/人 CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	克隆号 LG.3A10
抗人 CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	克隆号 L128
抗人 CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	克隆号 LT19
抗人 CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	克隆号 LT19
抗人 CD20-FITC	BD Biosciences	555622	克隆号 2H7
生物素标记抗人 CD27	Biolegend	302804	克隆号 O323
生物素标记抗人 CD27	eBioscience	13-0279-80	克隆号 O323
7-氨基放线菌素 D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
CpG (ODN 2006) 	InvivoGen	tlrl-2006	B 型 CpG
重组人 IL-2	PeproTech	200-02
重组人 IL-10	PeproTech	200-10
重组人 IL-21	PeproTech	200-21
重组人 sCD40L	PeproTech	310-02
&nbsp;<em>S. aureus</em>&nbsp;Cowan (SAC) 的蛋白 A	Sigma-Aldrich	82526
商陆有丝分裂原 (PWM)	Sigma-Aldrich	L9379
MultiScreen 滤膜板，0.45 &micro;m 孔径	Merck Millipore	MSIPS4510	无菌、透明 96 孔滤膜板，含疏水性 PVDF 膜
BCIP/NBT 溶液	Sigma-Aldrich	B6404
BCIP/NBT 单一试剂，碱性磷酸酶底物	Merck Millipore	ES006
人 IgG	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
人 IgG Fc 片段	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
山羊抗人 Ig (IgG+IgM+IgA) 的 F(ab')2&nbsp;片段	Jackson ImmunoResearch	109-006-127
山羊抗人 IgG-碱性磷酸酶，特异性识别 Fc&gamma; 片段	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
山羊抗人 IgM-碱性磷酸酶，特异性识别 Fc&micro; 片段	Jackson ImmunoResearch	109-055-095
山羊抗人 IgG-辣根过氧化物酶，特异性识别 Fc&gamma; 片段	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
山羊抗人 IgM-辣根过氧化物酶，特异性识别 Fc&micro; 片段	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
BD ELISPOT AEC 底物试剂盒	BD Biosciences	551951
C.T.L. ImmunoSpot 分析仪	C.T.L.