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所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。
1. 收集管的准备
- 通过在最低必需培养基α（MEM α）中添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素，制备骨髓间充质干细胞（BMSC）培养基。
- 将100 µL BMSC培养基加入1.5 mL微量离心管中。通常每根管可容纳3块骨组织，因此请根据需要准备相应数量的管子。
- 将200 µL移液器吸头的末端剪去适当长度，使其能够放入离心管中。将吸头插入管内，并确保管盖能够关闭，然后将管子置于冰上。
注意：也可将末端剪去的0.75 mL微量离心管插入1.5 mL微量离心管中。
2. 小鼠骨骼的采集
- 使用 CO₂ 处死动物2 随后进行颈椎脱位，并用70%乙醇喷洒。
注意： 确保使用同性别且尽可能同年龄的动物。我们通常使用7至8周龄的动物。建议将每实验组至少3只动物的细胞进行合并，以获得更具代表性且可重复的细胞群体。
- 将安乐死的小鼠仰卧置于解剖板上。用镊子在腹部提起皮肤形成帐篷状，使用无菌解剖剪做一个约1 cm的小切口。从切口处将皮肤向四肢和足部剥离，以暴露下腹部和腿部。
- 在踝关节下方剪切以去除足部。沿髋部的髂嵴剪切，使股骨头与髋骨分离。保持小鼠仰卧位，在髋骨中线处做切口，以分离两侧髂骨。
- 使用无绒布小心地从股骨、胫骨和髂骨上剥离肌肉。
注意： 尽可能多地剪除骨骼上的肌腱和肌肉，可使后续使用无绒布擦拭时清洁更快速、更简便（例如，Kim擦拭垫）。操作骨骼时需小心，因为骨骼容易断裂，且某些基因型可能会进一步增加其脆弱性。
- 所有样本解剖完成后，将其置于冰上的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并转移至无菌培养罩内，以进行后续的分离步骤。
注意： 尽可能保持无菌操作可降低培养物污染的风险。
- 在将骨骼放入离心管内的切口尖端之前，于骨骼的近端和远端各做小切口（约1至2毫米）。
注意： 确保切割足够长度的骨段，以便离心获取骨髓；但需注意避免切割过多，因为细胞群体会因在骨髓腔内的位置不同而有所差异。
- 在 10,000 x g 条件下离心 g 在室温下持续15秒。确保所有骨髓均被冲出并离心至1.5 mL离心管底部，此时骨骼仍置于插入物（如200 µL移液器吸头或0.75 mL微量离心管）内。收集完全部骨髓后，将带有骨骼的插入物从收集管中取出。
注意： 如果所有骨髓均已冲出，骨骼将呈现白色。然而，若某些骨骼中仍有骨髓残留，可尝试再次剪切骨端并进行离心。
3. 细胞悬液
- 使用25 G针头缓慢吹打细胞沉淀，以打散团块，并将所有样品合并至一个15 mL离心管中。每500 µL样品加入10 mL BMSC培养基。
- 将70 µm滤膜置于50 mL离心管上，将细胞悬液通过该滤膜过滤，以去除可能存在的骨碎片。
4. 骨髓细胞混合群体（总BMCs）的铺板与培养
注意：细胞在 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中培养。
- 计算细胞数量，并以 1.0 x 106 个细胞/cm2 的密度将细胞接种于培养基中。混合培养 72 小时，使细胞充分贴壁。
注意：建议将细胞悬液用培养基稀释 20 倍，再用台盼蓝稀释后，使用血细胞计数板进行细胞计数。对于 7 周龄的雄性 C57Bl6/J 小鼠，通常可获得约 50 x 106 个细胞，但细胞数量受动物年龄、性别和品系影响较大。
注意：应有一混合细胞群体贴附于培养孔底部。
- 72 小时后，移除旧培养基并更换为新鲜培养基。此后每隔一天更换一次培养基，并观察细胞融合度。当细胞融合度达到 80–100% 时，即可进行分化诱导。
注意：由于该培养体系中同时含有骨髓间充质干细胞（BMSCs）和造血干细胞（HSCs），可直接用于成骨分化、脂肪分化以及破骨细胞分化。
5. 骨髓间充质干细胞（贴壁型BMSCs）分裂群体的接种与培养
注意：细胞在37 °C、5% CO2的培养箱中培养。
- 将一只小鼠股骨、胫骨和髂骨中收集的所有细胞接种至一个10 cm的培养皿中（培养面积为55 cm2 ）。
注意：当合并2-3只C57BL/6J小鼠的细胞时，我们通常将这种“总”骨髓细胞群体接种于150 cm2 的培养瓶中。
- 混合培养48小时后，移除培养基（其中含有非贴壁的造血干细胞）。若需进行破骨细胞生成实验，请将这些非贴壁细胞保留备用；否则，吸除并丢弃这些细胞。
- 用PBS小心清洗培养皿或培养瓶，避免扰动已贴壁的细胞。
- 吸除PBS，加入0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育1-3分钟以消化细胞。加入细胞培养基终止胰酶消化反应。此时，已悬浮的骨髓间充质干细胞（BMSCs）可进行计数（方法同步骤4.1），并接种用于后续实验。
- 计算接种所需的细胞数量。取所需体积的细胞悬液，在室温下以1,000 × g 离心5分钟。
注意：细胞接种密度通常根据终点实验需求确定。例如，若需提取蛋白质或RNA，我们通常以较高密度接种（例如，在6孔板中每孔接种约1.0-2.0 × 106 个细胞）。
- 吸除培养基，将细胞沉淀重悬于适量培养基中，根据实验设计接种细胞，并在培养基中孵育数天使其贴壁。当BMSCs达到汇合状态时，即可进行分化诱导。
6. BMSCs 的分化
- 脂肪细胞
- 通过混合90 mL高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、10 mL胎牛血清、1 mL青霉素/链霉素、100 µL 20 mM罗格列酮和100 µL 2 mM胰岛素来制备脂肪细胞基础培养基。如有需要，可在分化实验期间将该培养基在4 °C下保存一周。
- 向25 mL脂肪细胞基础培养基中加入200 µL 62.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）和25 µL 1 mM地塞米松，制备脂肪细胞诱导培养基。
- 当BMSCs培养物（来自步骤4.3的总BMCs或来自步骤5.6的贴壁BMSCs）达到汇合状态时，更换为脂肪细胞诱导培养基。将此日记为分化的第0天。
- 48小时后，移除培养基，并用脂肪细胞诱导培养基更换培养液。
- 第4天，更换为脂肪细胞基础培养基。
注意：脂滴最早可能在第2天或第4天开始出现。
- 第7天，观察到细胞已积累最大量的脂滴，并呈现出类似于成熟脂肪细胞的表型。切勿继续培养超过此时间点，以免导致细胞死亡或脱落。