从人外周血单个核细胞中培养活化T细胞

摘要

来源：Mølgaard, K.，等. 细胞因子诱导分化的人原代T细胞中线粒体呼吸的实时监测. J. Vis. Exp. (2021)。

在本视频中，我们介绍了一种人原代T细胞活化的实验方案。将初始T细胞与包被有抗CD3和抗CD28抗体的磁珠共同孵育，随后用白细胞介素-2或白细胞介素-15处理，可诱导初始T细胞活化，并使其分化和增殖为效应T细胞或记忆T细胞。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 活化人原代T淋巴细胞的培养

1. 细胞解冻（第1天）
   1. 将每份样品的10 mL RPMI 1640培养基预热至约37 °C。
   2. 取出所需数量的外周血单个核细胞安瓿瓶，并暂时保存在干冰上。
   3. 将冻存的细胞重悬于10 mL预热的RPMI 1640培养基中。
   4. 在室温下以500 × g 离心5分钟。
   5. 弃去上清液，再用10 mL RPMI 1640培养基重悬细胞进行洗涤，并按步骤1.1.4所述条件离心。
   6. 弃去上清液，将细胞重悬于X-VIVO 15培养基（含5%人血清，以下简称T细胞培养基）中，浓度为每毫升2 × 10⁶ 个细胞。
   7. 将细胞以每孔2 mL接种至24孔细胞培养板中，于37 °C、5% CO₂ 条件下过夜培养。
2. 细胞激活（第0天）
   1. 将CD3/CD28磁珠按每100万个细胞12.5 µL的量转移至微量离心管中进行洗涤。每12.5 µL磁珠加入12.5 µL PBS。
      注意：使用前务必充分涡旋震荡磁珠原液瓶。
   2. 将微量离心管置于合适的磁力架上静置1分钟。
   3. 弃去上清液，将磁珠重悬于等体积的T细胞培养基中（即每12.5 µL磁珠加入12.5 µL T细胞培养基）。
   4. 按每百万个细胞加入12.5 µL磁珠的比例（磁珠:细胞 = 1:2）加入磁珠。
   5. 将细胞分为两种处理条件，每种条件约含500万个细胞。
   6. 根据表1中所述，向各处理条件中加入相应体积的细胞因子。
   7. 于37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞3天。
3. 细胞培养（第3天和第5天）
   1. 重悬细胞，通过将每孔中一半体积的细胞悬液转移至新孔中进行传代，并向每孔中加入等体积的新鲜T细胞培养基。
   2. 根据表1中所述，向各处理条件中加入新的细胞因子。

	细胞因子	储存液浓度	稀释倍数	终浓度
条件 1	IL-2	3 x 106 U/mL	30,000	100 U/mL
条件 2	IL-15	2 x 105 U/mL	2,000	100 U/mL

表1：用于引导T细胞代谢变化的细胞因子培养基的制备。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔组织培养板	Nunc	142485
抗CD3×CD28磁珠	Gibco	11161D
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F
人血清	Sigma Aldrich	H4522	56 °C 水浴30分钟灭活
IL-15	Peprotech	200-02
IL-2	Peprotech	200-15
Lymphoprep	Stemcell Technologies	7801
PBS	Thermo Fisher	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fisher	61870036
T细胞磁珠分离用DynaMag-2磁力架	Thermo Fisher	12321D