从小鼠胰腺引流淋巴结中鉴定调节性T细胞亚群

摘要

来源：Luo, Z., 等. 利用流式细胞术测定小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏中的调节性T细胞亚群. J. Vis. Exp.  (2019)

在本视频中，我们介绍了一种从小鼠胰腺引流淋巴结（PDLNs）中分离单个细胞的方案，并通过流式细胞术对单细胞群体中的调节性T细胞（Tregs）进行表征。Tregs的鉴定依据是细胞表面标志物CD4、CD25和Nrp1的阳性表达，以及核转录因子Foxp3和Helios的表达。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 从PDLN中分离单细胞

1. 将无菌的250 µm金属筛网置于置于架上的15 mL锥形管上，用1 mL RPMI冲洗筛网。
2. 将淋巴结转移至金属筛网上，使用一对镊子将其研磨过筛。在金属筛网上加入1 mL RPMI，以冲洗细胞进入管中。重复此步骤3次，然后移除筛网。
3. 在4 °C条件下，以433 × g离心5分钟。弃去上清液。
4. 用约5 mL RPMI重悬细胞沉淀。用RPMI充满离心管。
5. 在4 °C条件下，以433 × g离心5分钟。弃去上清液。
6. 用约5 mL RPMI重悬细胞沉淀。用RPMI充满离心管。
7. 在4 °C条件下，以433 × g离心5分钟。弃去上清液。
8. 用2 mL RPMI重悬细胞沉淀。将2 mL细胞悬液转移至带有细胞筛帽的5 mL圆底管中。将细胞悬液加至细胞筛帽上。

2. 流式细胞术

1. 将来自PDLN的细胞悬液在4 °C条件下以433 × g离心5分钟，弃去上清液。
2. 在100 µL流式细胞术染色缓冲液（FACS缓冲液）中，使用以下表面抗体对细胞进行染色：0.75 µg/100 µL FITC标记的CD4抗体、0.60 µg/100 µL APC-H7标记的CD8抗体、0.30 µg/100 µL PE标记的CD25抗体、5 µL（1:20）APC标记的Nrp1抗体。将样品管置于冰上孵育40分钟。
3. 向每管中加入200 µL FACS缓冲液，在4 °C条件下以433 × g离心5分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。
4. 用500 µL通透固定缓冲液（PFB）重悬细胞沉淀，以进行细胞固定和通透。
   注意：PFB通过将1份固定/通透浓缩液与3份固定/通透稀释液混合配制而成。
5. 将样品管置于4 °C冰箱中过夜。
   注意：孵育1小时也可达到效果。
6. 在4 °C条件下以433 × g离心5分钟，弃去上清液。
7. 用500 µL通透洗涤缓冲液（PWB）重悬细胞沉淀，在4 °C条件下以433 × g离心5分钟，弃去上清液。
   注意：PWB通过将10倍浓度的通透缓冲液按1:10比例用蒸馏水稀释配制而成。
8. 在100 µL PWB中，使用以下细胞内抗体对细胞进行染色：0.30 µg/100 µL PE-Cy7标记的Foxp3抗体、4 µL（1:25）PacificBlue标记的Helios抗体。将样品管置于冰上孵育1小时。
9. 向每管中加入500 µL PWB，在4 °C条件下以433 × g离心5分钟，弃去上清液。
10. 用500 µL PWB重悬细胞沉淀，在4 °C条件下以433 × g离心5分钟，弃去上清液。
11. 用300 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀。
12. 在流式细胞仪上分析细胞。
13. 根据侧向散射-面积、高度和宽度，以及前向散射-面积、高度和宽度对单个细胞设门，每样本采集一百万个事件用于分析。
14. 导出实验的FCS文件，并使用流式细胞术分析软件进行数据分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
eBioscience Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装	ThermoFisher	00-5523-00	包含固定/透化浓缩液、固定/透化稀释液和透化缓冲液（10倍浓度）
eBioscience 流式细胞术染色缓冲液	ThermoFisher	00-4222-26
CD4 单克隆抗体 (RM4-5)，FITC，eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
CD25 单克隆抗体 (PC61.5)，PE，eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 大鼠抗小鼠 CD8a	BD 生物科学	560182
小鼠 Neuropilin-1 APC 标记抗体	R&D 系统	FAB5994A
FOXP3 单克隆抗体 (FJK-16s)，PE-Cyanine7，eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Pacific Blue 抗小鼠/人 Helios 抗体	BioLegend	137220
Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞滤网卡扣盖	CORNING	352235	卡扣盖中集成有 35 µm 尼龙滤网
15 mL 试管，120 mm × 17 mm，聚丙烯材质	Sarstedt	62.554.002
流式细胞术	BD
流式细胞术分析软件	Inivai Technologies	Flowlogic