一种体外分化巨核细胞及形成血小板的方法

摘要

来源：Perdomo, J., 等. 人脐带血来源的CD34+细胞向巨核细胞分化及血小板生成. J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了一种巨核细胞分化及血小板形成的实验技术。从人脐带血中分离的造血干祖细胞在血小板生成素存在条件下，可分化为成熟的巨核细胞。成熟的巨核细胞产生称为前血小板的胞质突起，进而形成单个血小板。

方案

所有涉及人类受试者的操作均按照机构、国家及国际关于人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核。

1. 巨核细胞分化

1. 在12孔板中，每孔加入2 mL添加了50 ng/mL重组人血小板生成素（rhTPO）的无血清培养基（SFM），以5 × 10⁵ 个细胞/mL的密度接种CD34⁺细胞。将细胞置于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育。若细胞在分析前已长满，需收集细胞并用新鲜培养基和rhTPO将其分种至多个新孔中。
   注意：应专门准备两到三个孔，用于在不同时间点（例如，第7、9、10天）监测细胞分化情况。
2. 收集预留用于监测分化的孔中的细胞，注意不要扰动其他孔中的细胞。
3. 在终体积为100 µL的溶液中，加入20 µL抗GPIIb/CD41-FITC抗体和10 µL抗GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647抗体对细胞进行染色。设置对照管，使用相应的同型对照抗体。在4 °C孵育15–30分钟。
4. 加入1 mL SB缓冲液洗涤。以400 × g离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于200–300 µL SB缓冲液中。通过流式细胞术进行分析。
5. 针对每种荧光染料，分析同型对照以设定FITC和Alexa Fluor 647阳性群体的门控。分析染色后的细胞样本，确定CD41⁺/CD42a⁺双阳性细胞的百分比，该群体代表成熟的巨核细胞（图1C）。
6. 如需通过显微镜观察细胞表面标志物，请按照步骤1.3所述方法对细胞进行染色。
   1. 加入1 mL SB缓冲液洗涤。以400 × g离心10分钟。将沉淀重悬于100 µL SB缓冲液中，并以1,000 × g速度离心5分钟，使细胞沉降到玻片上。将玻片浸入甲醇中30秒以固定细胞。自然晾干后，加入20 µL含DAPI的封片剂（见材料表），加盖盖玻片，使用荧光显微镜观察（图2A）。
7. 如需观察细胞内抗原，将细胞重悬于PBS中，并用终浓度为1%的多聚甲醛在室温下固定15分钟。为实现细胞通透，加入0.1% Triton-X 100，孵育15分钟。用2 mL PBS/0.1% Triton-X 100洗涤细胞。将细胞重悬于100 µL PBS/0.1% Triton-X 100中，加入抗vWf和抗CD62p抗体（1:200稀释），室温孵育30分钟。
   1. 用2 mL PBS/0.1% Triton-X 100洗涤，400 × g离心10分钟，将沉淀重悬于100 µL相同缓冲液中，加入抗小鼠IgG-Alexa 594和抗兔IgG-Alexa 488抗体（1:100稀释），室温孵育30分钟。再次用2 mL PBS/0.1% Triton-X 100洗涤，将沉淀重悬于100 µL相同缓冲液中，加入20 µL抗CD42b-APC抗体。然后按照步骤1.6.1所述方法将细胞离心至玻片上，并按步骤1.6.1所述方法制备样本用于显微观察。
8. 进行倍性分析时，在分化第12或第13天收集细胞。加入1 mL SB缓冲液洗涤。以400 × g离心10分钟，然后在终体积为100 µL的溶液中加入20 µL抗GPIIb/CD41-FITC抗体进行染色。在4 °C避光孵育30分钟。
   1. 用1 mL SB缓冲液洗涤一次，将沉淀重悬于300 µL低渗柠檬酸盐缓冲液（含1.25 mM柠檬酸钠、2.5 mM氯化钠、3.5 mM葡萄糖）中，其中含20 µg/mL碘化丙啶和0.05% Triton-X 100。在4 °C避光孵育15分钟。
   2. 加入RNase至终浓度为20 µg/mL，在4 °C避光孵育30分钟。通过流式细胞术检测碘化丙啶荧光强度，采集CD41-FITC⁺群体的30,000至50,000个事件进行分析（图2C）。

2. 前血小板计数、血小板定量及血小板活化

1. 在分化第8或第9天收集细胞（来自步骤1.1），并以1 × 10⁶⁴ 细胞/孔，接种于48孔板中，每孔体积为200 µL，使用含50 ng/mL rhTPO的新鲜SFM培养。于37 °C、5% CO₂条件下培养5天₂.
   注意： 为定量目的，每组设三个重复孔接种细胞。此低密度培养条件有助于产血小板巨核细胞的观察与计数。培养2天后通常开始出现前血小板结构，第4至5天达到高峰。
2. 在倒置显微镜下使用10倍或20倍物镜，计数整个孔中带有前血小板的巨核细胞数量。
   注意： 建议使用加热（37 °C）的显微镜载物台，因为将巨核细胞长时间置于室温下会导致前血小板突起收缩。前血小板表现为从巨核细胞体延伸出的长形突起，每个巨核细胞可能具有多个前血小板突起。随着前血小板的发育，巨核细胞的胞体体积逐渐减小。
3. 收集细胞并在 400 x g 室温孵育10分钟。按照步骤1.3和1.4所述，用20 µL抗人CD41-FITC抗体对细胞进行染色。计算携带前血小板的巨核细胞（pbMK）百分比：
   pbMK (%) = [(形成前血小板的巨核细胞/孔) / (总CD41+细胞/孔)] × 100
4. 为了计数培养基中释放的血小板，使用巴斯德吸管轻轻混匀细胞，在培养第14天或第15天收集100 µL培养液。
   1. 使用20 µL抗人CD41-FITC抗体在4 °C避光孵育20–30分钟。同时设置同型对照管，使用相应的同型对照抗体。
   2. 加入150 µL SB和50 µL计数微球。
   3. 进行流式细胞术分析时，将FSC和SSC设置为对数刻度。使用2.4.1节所述经CD41-FITC染色的富血小板血浆中正常人血小板，设定血小板的门控图3A).
   4. 通过流式细胞术对染色后的血小板进行分析，计数计数微球。使用FSC与SSC散点图收集1,000个计数微球事件图3A）。根据 CD41-FITC 阳性事件计算血小板数量（图3B）使用公式：
      每微升血小板数 = [（CD41-FITC 阳性事件数）/ 1,000 个微球] × [（50 µL 中的微球数）/ 样本体积]
5. 为分析血小板活化，于培养第14或15天轻轻混匀细胞，用巴斯德吸管吸取100 µL细胞悬液。加入1 mL Tyrode's缓冲液（137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 0.42 mM NaH₂PO₄, 12 mM NaHCO₃, 5.6 mM glucose, 0.35% BSA, pH 6.5），在37 °C条件下孵育15分钟。随后加入抗人CD62P-PE单克隆抗体（1:100稀释）和抗人CD63-FITC单克隆抗体（1:100稀释），避光冰上孵育30分钟。用1 mL Tyrode's缓冲液洗涤细胞，1,200 × g离心5分钟，弃上清。将细胞重悬于300 µL Tyrode's缓冲液中，采用流式细胞术在2小时内完成分析。₂，1.8 mM CaCl₂，0.2 mM Na₂HPO₄，12 mM NaHCO₃₃，5.5 mM D-葡萄糖，pH 6.5）并以 200 × g 离心 g 离心5分钟以收集细胞。
   1. 收集上清液，并在800 x g 10 分钟，以沉淀血小板大小的颗粒。
   2. 弃去上清液，用 100 µL Tyrode's 缓冲液重悬。加入 20 µL PAC1-FITC 抗体和二磷酸腺苷（ADP），使 ADP 终浓度为 20 µM。室温孵育 20 分钟。通过流式细胞术分析，确定 FITC 阳性事件的百分比。以经相同处理的新鲜人血小板作为阳性对照（图3C).

结果

图1：CD34+细胞分离及在培养中向巨核细胞分化的流式细胞术图谱 (A单个核细胞（如左图所示设门）从人脐带血中分离后，用抗CD34-PE抗体染色，以确定CD34阳性细胞的百分比⁺ 样本中的细胞（1.3%，右图）。 （B） 分离后，阳性组分用抗-CD34-PE和抗-CD45 PerCP抗体进行染色。富集的CD34⁺ 群体比例在图中显示（98.1%，右图，右上象限）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>细胞培养试剂</strong>
重组人TPO	Miltenyi Biotec	130-094-013
StemSpan SFEM II	干细胞技术	9605	CD34+细胞的无血清培养基
<强>流式细胞术与细胞染色试剂</strong>
PE 小鼠抗人 CD34	BD 生物科学	340669	克隆8G12。可用于CD34纯度检测。终抗体浓度为1:10稀释。
PerCP 小鼠抗人 CD45	BD 生物科学	347464	1:10 稀释
PerCP 同型对照	BD 生物科学	349044	1:10 稀释
FITC 标记小鼠抗人 CD41a	BD 生物科学	340929	最终抗体浓度为1:5稀释。
APC 小鼠抗人 CD42b	BD 生物科学	551061	该抗体也可用于检测成熟的巨核细胞（阳性细胞百分比较抗CD42a低）。最终抗体浓度为1:10稀释。
Alexa Fluor 647 小鼠抗人 CD42a	AbD Serotec	MCA1227A647T	目前由 Bio-Rad 销售。终抗体浓度为 1:10 稀释。
Alexa Fluor 647 小鼠阴性对照	AbD Serotec	MCA928A647	目前由 Bio-Rad 销售。同型对照抗体
兔抗血管性血友病因子多克隆抗体	Abcam	AB6994	1:200 稀释
V450 小鼠抗人 CD41a	BD 生物科学	58425	1:20 稀释
V450 同型对照	BD 生物科学	580373	1:20 稀释
PAC1-FITC 抗体	BD 生物科学	340507	1:10 稀释
抗CD62p小鼠单克隆抗体	Abcam	AB6632	1:200 稀释度
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG	Invitrogen	A11008	1:100 稀释度
Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG	Invitrogen	A11020	1:100 稀释度
Ig同型对照混合物-C	BD 生物科学	558659	同型对照抗体
碘化丙啶	Sigma Aldrich	P4864
CountBright 绝对计数微球	分子探针，英吉瑞	C36950	计数微珠
<强>材料</strong>
Falcon 5 mL 圆底聚丙烯 FACS 管，带卡扣盖，无菌	体外技术	352063
载玻片	Menzel-Glaser	J3800AMNZ
含DAPI的封片剂	Vector Laboratories	H-1200	含DAPI的抗荧光淬灭封片剂
<强>仪器设备</strong>
倒置显微镜	Leica	DMIRB 倒置显微镜
荧光显微镜	Zeiss	Vert.A1
细胞分析仪	BD 生物科学	FACS Canto II
细胞离心涂片机	赛默飞世尔科技	Cytospin 4
<强>软件</strong>
细胞分析仪软件	BD 生物科学	FACS Diva 软件
单细胞分析软件	Tree Star	FlowJo
荧光显微镜软件	Zeiss	Zen 2 蓝色版