一种用于区分巨核细胞和血小板形成的体外方法

摘要

来源:Perdomo， J. 等人。 人脐带血来源的 CD34 + 细胞的巨核细胞分化和血小板形成。J. Vis. Exp.（2017 年）

该视频演示了一种分化巨核细胞和形成血小板的技术。造血干细胞祖细胞 — 从人脐带血中分离 — 在血小板生成素存在下分化为成熟的巨核细胞。成熟的巨核细胞产生称为前血小板的细胞质延伸，从而产生单个血小板。

方案

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利指南执行，并已由当地机构审查委员会审查。

1. 巨核细胞分化

1. 在 12 孔板中，将 5 ×^{10 个 5} 个细胞/mL CD34 ⁺ 细胞接种在 2 mL 补充有 50 ng/mL 重组人血小板生成素 （rhTPO） 的 SFM 中。在 37 °C、5% CO₂ 的潮湿环境中孵育细胞。如果细胞在需要分析之前汇合，则收获细胞并使用新鲜培养基和 rhTPO 将它们分成多个孔><中。 注意: 应专门准备 2 或 3 个孔来监测不同时间点（例如，第 7 、 9 和 10 天）的分化。
2. 从留置的孔中收获细胞以监测分化，而不会干扰其他孔中的细胞。
3. 用 20 μL 抗 GPIIb/CD41-FITC 抗体和 10 μL 抗 GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 抗体对细胞进行染色，最终体积为 100 μL。使用相应的同种型对照抗体设置对照管。在 4 °C 下孵育 15 - 30 分钟。
4. 加入 1 mL SB 进行洗涤。以 400 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 200 - 300 μL SB 中。通过流式细胞术分析。
5. 对于每个荧光团，分析同种型对照以设置 FITC 和 Alexa Flour 647 阳性群体的设门。分析染色的细胞样品以确定代表成熟 MK 的 CD41 ⁺ / CD42a ⁺ 双阳性细胞的百分比（图 1C）。
6. 为了细胞表面标志物的显微镜观察，如 1.3 中所述对细胞进行染色。
   1. 加入 1 mL SB 进行洗涤。以 400 × g 离心 10 分钟。将沉淀重悬于 100 μL SB 中，并以 1,000 x g 的速度旋转到载玻片上 5 分钟。通过将细胞浸入甲醇中 30 秒来固定载玻片上的细胞。风干，加入 20 μL 含有 DAPI 的封固剂（参见材料表），盖上盖玻片，并使用荧光显微镜观察（图 2A）。
7. 为了观察细胞内抗原，将细胞重悬于 PBS 中，并在室温下用多聚甲醛（1% 终浓度）固定 15 分钟。要透化细胞，加入 triton-X 100 （0.1%） 并孵育 15 分钟。用 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 洗涤细胞。重悬于 100 μL PBS/0.1% triton-X 100 中，添加抗 vWf 和抗 CD62p 抗体（1:200 稀释），并在室温下孵育 30 分钟。
   1. 用 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 洗涤并以 400 × g 离心 10 分钟，重悬于 100 μL 相同缓冲液中，并加入抗小鼠 IgG-Alexa 594 和抗兔 IgG-Alexa 488 （1:100）。在室温下孵育 30 分钟，用 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 洗涤，重悬于 100 μL 相同缓冲液中，并加入 20 μL 抗 CD42b-APC。然后按照步骤 1.6.1 中的说明将细胞旋转到载玻片上，并按照步骤 1.6.1 中的说明准备用于显微镜观察的样品。
8. 对于倍性测定，在分化的第 12 天或第 13 天收获细胞。加入 1 mL SB 进行洗涤。以 400 × g 离心 10 分钟，并用 20 μL 抗 GPIIb/CD41-FITC 抗体染色，终体积为 100 μL。在 4 °C 下孵育 30 分钟。
   1. 用 1 mL SB 洗涤一次，然后将沉淀重悬于 300 μL 低渗柠檬酸盐缓冲液（1.25 mM 柠檬酸钠、2.5 mM 氯化钠、3.5 mM 葡萄糖）中，其中含有 20 μg/ml 碘化丙啶和 0.05% Triton-X 100。在 4 °C 避光孵育 15 分钟。
   2. 加入 RNase 至终浓度为 20 μg/mL，并在 4 °C 避光孵育 30 分钟。通过收集 CD41-FITC+ 群体的 30,000 至 50,000 个事件，通过流式细胞术确定碘化丙啶^的强度（图 2C）。

2. 血小板计数、血小板计数和血小板活化

1. 在分化第 8 天或第 9 天收获细胞（来自步骤 1.1），并以 1 × 10⁴ 个细胞/孔在 48 孔板中接种 200 μL 补充有 50 ng/mL rhTPO 的新鲜 SFM。在 37 °C、5% CO₂.
   下培养 5 天 注意: 为了定量目的，一式三份接种孔。这种低密度是观察和计数含血小板的前血小板 MK 所必需的。前血小板通常在培养 2 天后开始出现。高峰期在第 4 天到第 5 天之间。
2. 在倒置光学显微镜上使用 10 倍或 20 倍物镜计算整个孔中含血小板的 MK 的数量。
   注意:加热 （37 °C） 显微镜载物台是优选的，因为将细胞长时间保持在室温下会导致血小板延伸部分收缩。观察到前血小板是从 MK 体延伸而来的。每个 MK 可能有几个血小板前突起。随着血小板的发育，MK 体的大小减小。
3. 收获细胞并在室温下以 400 x g 离心 10 分钟。用 20 μL 抗人 CD41-FITC 抗体对细胞进行染色，如步骤 1.3 和 1.4 所述。计算含血小板前体 MK （pbMK） 的百分比:
   pbMK （%） = [（含血小板前体的 MKs/孔） / （总 CD41+ 细胞/孔）] x 100
4. 要计数释放到培养基中的血小板，请用巴斯德移液管轻轻混合细胞，并在培养第 14 天或第 15 天收集 100 μL。
   1. 在 4 °C 下用 20 μL 抗人 CD41-FITC 抗体染色 20 - 30 分钟。使用相应的同种型对照抗体设置对照管。
   2. 加入 150 μL SB 和 50 μL 计数珠。
   3. 对于流式细胞术分析，将 FSC 和 SSC 设置为对数刻度。如第 2.4.1 节所述，使用来自用 CD41-FITC 染色的富血小板血浆的正常人血小板来设置血小板的门控（图 3A）。
   4. 通过流式细胞术对珠子进行计数来分析染色的血小板。使用 FSC 与 SSC 散点图收集 1,000 个计数珠事件（图 3A）。使用以下公式根据 CD41-FITC 阳性事件（图 3B）计算血小板数量:
      每 μL 血小板=[（CD41-FITC 阳性事件数）/1,000 个微珠）] x [（50 μL 中的微珠数）/样品体积）]
5. 要分析血小板活化，请用巴斯德移液管轻轻混合细胞，并在培养第 14 天或第 15 天收集 100 μL。加入 1 mL Tyrode 缓冲液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl₂、1.8 mM CaCl₂、0.2 mM Na₂HPO₄、12 mM NaHCO₃、5.5 mM D-葡萄糖，pH 6.5）并以 200 x g 离心 5 分钟以沉淀细胞。
   1. 收集上清液并以 800 x g 离心 10 分钟以沉淀血小板大小的颗粒。
   2. 弃去上清液并重悬于 100 μL Tyrode 缓冲液中。加入 20 μL PAC1-FITC 抗体和二磷酸腺苷 （ADP） 至终浓度为 20 μM。在室温下孵育 20 分钟。通过流式细胞术进行分析以确定 FITC 阳性事件的百分比。使用以与阳性对照相同的方式处理的新鲜人血小板（图 3C）。

结果

图 1:培养物中 CD34+ 细胞分离和 MK 分化的流式细胞术图。（A） 用抗 CD34-PE 抗体对从人脐带血中纯化的单核细胞（如左图所示的门控）进行染色，以确定样品中 CD34⁺ 细胞的百分比（1.3%，右图）。（B） 分离后，阳性组分用抗 CD34-PE 和抗 CD45 PerCP 抗体染色。图中显示了富集的 CD34 ⁺ 群体（98.1%，右图，右上象限）。（C） 用抗 CD41 和抗 CD42a 抗体对 CD34 + 细胞体外分化 7 天或 11 天的 MK 进行表型分析。成熟 MK 的 CD41 ⁺ 和 CD42a ⁺ （右上象限） 均呈阳性。

图 2:体外 MK 染色、倍性和血小板前形成。（A） 用抗 CD41-PE 和 CD42b-APC 抗体染色的第 11 天 MK 的荧光图像。细胞核用 DAPI 染色。黄色箭头表示多核 MK。比例尺，30 μm。（B） 用抗 vWf（绿色）、抗 CD62p（红色）和抗 CD42b-APC（品红色）抗体染色的第 14 天 MK 的荧光图像。细胞核用 DAPI 染色。比例尺，15 μm （C） 显示 CD41 ⁺ 事件倍性分布的代表性门控策略。图表（下图）显示了观察到的倍性类别 （n = 4）、误差线、SD 的分布。（D） 显示了携带血小板的前列 MK 的特征性形态。MK 主体由箭头指示。从 MK 延伸的长细胞质过程（前血小板）用箭头表示。在某些区域/视野中，可能不清楚一个还是两个 MK 正在产生这些血小板扩展。这应算作一个含血小板的 MK。使用倒置显微镜 10 倍物镜拍摄的图像。比例尺，50 μm。

图 3:体外产生的血小板丰度和血小板活化。（A） 使用来自富血小板血浆的人血小板，使用前向和侧向散射的对数刻度设置分析门（左图）。右图显示了来自 MK 培养物的细胞。在为人血小板定义的分析门中观察到体外产生的血小板。细胞和计数珠如图所示。Plt、血小板 （B） 体外产生的血小板用抗 CD41 抗体染色。使用来自富血小板血浆的人血小板，使用前向和侧向散射的对数刻度设置分析门，并比较 CD41-FITC 门内的曲线。C-FITC、FITC 同种型对照 （C） ADP 处理至终浓度为 20 μM 后的血小板活化。来自富血小板血浆的人血小板用作对照（上图）。培养物中产生的血小板显示在下面的面板中。PAC1 抗体的结合表明血小板活化。C-FITC、FITC 同种型对照。

材料

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 细胞培养试剂 重组人 TPO Miltenyi Biotec 公司 130-094-013 StemSpan SFEM II 干细胞技术 9605 元 用于 CD34+ 细胞的无血清培养基 流式细胞术和细胞染色试剂 PE 小鼠抗人 CD34 BD生物科学公司 340669 克隆 8G12。这可用于 CD34 纯度检查。最终抗体浓度 1:10 稀释。 PerCP 小鼠抗人 CD45 BD生物科学公司 347464 1:10 稀释 PerCP 同种型对照 BD生物科学公司 349044 1:10 稀释 FITC 小鼠抗人 CD41a BD生物科学公司 340929 最终抗体浓度 1:5 稀释。 APC 小鼠抗人 CD42b BD生物科学公司 551061 该抗体还可用于检测成熟 MK（阳性细胞的百分比通常低于抗 CD42a）。最终抗体浓度 1:10 稀释。 Alexa Fluor 647 小鼠抗人 CD42a AbD Serotec 公司 MCA1227A647T 目前由 Bio-Rad 发行。最终抗体浓度 1:10 稀释。 Alexa Fluor 647 小鼠阴性对照 AbD Serotec 公司 MCA928A647 目前由 Bio-Rad 发行。同种型对照抗体 抗血管性血友病因子兔多克隆抗体 Abcam 中文官网 编号: AB6994 1:200 稀释 V450 小鼠抗 humna CD41a 抗体 BD生物科学公司 58425 1:20 稀释 V450 同种型对照 BD生物科学公司 580373 1:20 稀释 PAC1-FITC 抗体 BD生物科学公司 340507 1:10 稀释 抗 CD62p 小鼠单克隆抗体 Abcam 中文官网 编号 AB6632 1:200 稀释 Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG Invitrogen 公司 编号 A11008 1:100 稀释 Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG Invitrogen 公司 编号 A11020 1:100 稀释 Ig 同型对照混合物-C BD生物科学公司 558659 同种型对照抗体 碘化丙啶 西格玛·奥尔德里奇 货号 P4864 CountBright 绝对计数微珠 Molecular Probes，Invitrogen 编号 C36950 计数珠子 材料 Falcon 5mL 圆底聚丙烯 FACS 管，带卡口盖，无菌 体外技术 352063 载玻片 门泽尔-格拉泽 J3800AMNZ 使用 DAPI 安装介质 矢量实验室 H-1200 型 含 DAPI 的抗淬灭封片剂 设备 倒置显微镜 徕卡 DMIRB 倒置显微镜 荧光显微镜 蔡司 Vert.A1 版本 细胞分析仪 BD生物科学公司 FACS Canto II Cytospin 离心机 Thermo Scientific 公司 细胞离心涂片 4 软件 细胞分析仪软件 BD生物科学公司 FACS Diva软件 单细胞分析软件 树星 FlowJo 系列 荧光显微镜软件 蔡司 Zen 2 蓝色版