用于生成诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

摘要

来源：Vizcardo, R.，等。一种用于生成小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种利用三维胸腺培养系统，从诱导多能干细胞（iPSC）来源的不成熟T细胞生成具有功能性的抗原特异性T细胞的实验方案。将iPSC来源的不成熟T细胞与内源性淋巴细胞耗竭的小鼠胎儿胸腺叶共培养后，T细胞成功成熟，形成CD8αβ+ MHC I类分子阳性iPSC来源的胸腺移出细胞（iTEs）。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 生成诱导性胸腺上皮细胞的三维胸腺器官培养

1. 收获小鼠胎儿胸腺叶，并通过脱氧鸟苷（dGUO）处理去除内源性淋巴细胞。
2. dGUO处理第7天，取四个新的10 cm培养皿，每个加入20 mL完全培养基（RPMI 1640培养基 + 10% 胎牛血清 + 1× L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 + 1× 丙酮酸钠 + 1× 含非必需氨基酸的最低必需培养基（MEM-NEAA） + 1× 青霉素-链霉素 + [1:1000] 2-巯基乙醇）。
3. 将所有带有胸腺叶的硝酸纤维素膜转移至一个10 cm培养皿中。用镊子将各个胸腺叶从膜上分离，使其浸入培养基中。弃去硝酸纤维素膜。室温孵育1小时。
4. 将胸腺叶转移至另一含完全培养基的新10 cm培养皿中，室温孵育1小时。重复此步骤两次。
5. 用镊子固定胸腺叶（每次一个），另一只手持工具在胸腺叶中心做一切口，深度为100–200 µm，长度延伸至叶直径的一半，以促进T细胞前体迁移进入胸腺叶。
6. 将胸腺叶转移至新10 cm培养皿中，该培养皿内含完全分化培养基（完全培养基 + 5 ng/mL小鼠白细胞介素-7（IL-7） + 5 ng/mL小鼠Flt3配体（FLT3L） + 5 ng/mL干细胞因子（SCF））。
7. 可选：若使用具有上下层网格的3D培养板，需向两层网格中加入无菌PBS，以防止悬滴蒸发和干燥。
8. 从步骤1.6中取出含一个dGUO处理胸腺叶的30 µL完全培养基，分别加入3D培养板的每孔中。
9. 收集OP9/DLL1共培养体系中第16–21天的非贴壁T系细胞（iPSC来源的未成熟T细胞），重悬于培养基中，浓度为每20 µL含2–5 × 10³个T系细胞。
10. 向3D培养板中每个胸腺叶加入20 µL T系细胞悬液。37 °C、5% CO₂条件下过夜孵育。
11. 将P200移液器调至30 µL，反复吹打每孔液体数次后吸出培养基，以去除胸腺叶周围的全部细胞。弃去培养基，加入30 µL完全培养基。重复此操作5–7次，以清除未迁移进入胸腺叶的额外未成熟T细胞。此后每日更换25–30 µL培养基。
12. 自第4–5天起，通过光学显微镜观察确认iPSC来源的胸腺迁出细胞（iTE）在胸腺叶周围形成晕环状结构。
13. 每日通过移液方式收集iTE，避免破坏胸腺叶。每天更换培养基，并持续收集约12天。
14. 收获的iTE可用于分子分析（图1、图2、图3和图4）或体内移植实验。

结果

图1： 植入由iPSC分化而来的未成熟T细胞的胸腺小叶的免疫组织化学分析。 上图：植入与未植入由iPSC分化而来的未成熟T细胞的胸腺小叶的H&E染色结果。从上至下第二行开始：对切片小叶进行染色后的共聚焦图像，染色标记包括DAPI（细胞核）、CD3（T细胞）以及合并图像。比例尺 = 100 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
 2-脱氧鸟苷	Sigma-Aldrich	312693-72-4
2-巯基乙醇（1,000倍稀释） 	Thermo Fisher Scientific 	21985-023
FBS 	Gemini 	100-500
Flt-3 配体 	R&D Systems 	427-FL
白细胞介素-7 	R&D Systems 	407-ML
MEM 非必需氨基酸溶液	Gibco	11140050
MEM 粉末	Gibco	61100061
丙酮酸钠 	Thermo Fisher Scientific 	11360-070
干细胞因子（SCF） 	R&D Systems 	455-MC
青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140-122
磷酸盐缓冲液 pH 7.4（1倍）	Thermo Fisher Scientific	10010-023
RPMI 1640	Gibco	11875093
10 cm 培养皿	Corning, Inc	353003
Perfecta3D 悬滴培养板 	Sigma-Aldrich 	HDP1096
镊子	DUMONT	0108-5PO
OP9/N-DLL1	Riken 生物资源中心	货号 RCB2927；RRID:CVCL_B220
GlutaMAX（100倍稀释） 	Thermo Fisher Scientific 	35050-061