从肝组织中分离自然杀伤细胞以实现选择性扩增

摘要

来源：Ma, M., 等. 利用膜结合IL-21修饰B细胞系扩增自然杀伤（NK）细胞和CAR-NK细胞的方法. 视频实验杂志 (180), e62336, doi:10.3791/62336 (2022).

本视频演示了从人肝组织中分离淋巴细胞（包括自然杀伤细胞或NK细胞）以进行选择性扩增的方法。通过酶消化和机械消化，随后进行密度梯度分离，可有效促进包括NK细胞在内的淋巴细胞分离。所获得的淋巴细胞可用于NK细胞的选择性扩增。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际关于人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 从小鼠肝脏组织中扩增自然杀伤细胞（第0天），如图1所示。

注意：初始细胞数量和活力与器官摘除后的时间以及初始组织样本量密切相关。然而，如果将组织置于30 mL汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中，并在冰上或4 °C冰箱中过夜保存，则自然杀伤细胞（NK细胞）仍可在24小时后以高纯度和高活力进行扩增。

1. 使用无菌外科器械识别可存活的组织区域，以从中获取淋巴细胞。
2. 将组织置于 30 mL 的 HBSS（不含钙或镁）中，并置于冰上保存，直至准备进行分离处理。
3. 在生物安全柜内，使用无菌剃刀片或剪刀和镊子将组织切成 <0.5 cm 的小块。
4. 通过将 10x 储存液用 HBSS 稀释，配制 1x 胶原酶 IV 溶液（1 mg/mL）（10x 胶原酶 IV：10 mg/mL 或约 200 U/mL）。
5. 将切碎的组织块放入组织解离管中。每管中组织量不超过 4 g，并用约 10 mL 的 1x 胶原酶 IV 浸没组织块。
   注意：不建议使用 DNase I，因其可能轻微降低自然杀伤细胞（NK）的存活率和得率。有关所用特定组织解离管的信息，请参见材料表。
6. 将组织解离管放入组织解离仪中，在 37 °C 下充分搅拌以彻底解离组织。
   注意：肝脏组织可能需要超过 30 分钟；而对于较易解离的组织，约 15 分钟即可。有关所用特定组织解离管及组织解离仪的信息，请参见材料表。
7. 取出组织解离管，用 5 mL 注射器的推杆将悬液通过 40 µm 尼龙细胞滤网进行吹打。收集滤过液，并弃去未消化的大块组织碎片。
8. 在室温下以 400 x g 离心 5 分钟，沉淀细胞。吸除上清液。
9. 将细胞沉淀重悬于 30% 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包被的二氧化硅中，以去除可能污染最终淋巴细胞组分的脂肪细胞。
   1. 配制 1x PVP 包被的二氧化硅时，使用 PVP 包被的二氧化硅与 10x PBS 按 9:1 比例稀释。
      注意：有关所用特定 PVP 包被二氧化硅的信息，请参见材料表。
   2. 配制 30% PVP 包被的二氧化硅时，用 PBS/HBSS 将 1x PVP 包被的二氧化硅稀释。
10. 在室温下以 400 x g 离心 5 分钟，沉淀细胞。吸除上清液。
11. 将细胞沉淀重悬于 9 mL R-10 培养基中。
    注意：有关 R-10 培养基成分的信息，请参见材料表。
12. 小心地将细胞悬液叠加于 4 mL Ficoll 或淋巴细胞分离液之上，以分离淋巴细胞与红细胞及多形核细胞。
13. 在室温下以 400 x g 离心 23 分钟，加速度和刹车设为关闭或最低档位。小心倾去上层培养基，收集含有组织浸润性淋巴细胞的界面层。
14. 用 10 mL 培养基清洗细胞，随后进行细胞计数、流式细胞术分析、分装、冻存，或进行原代 NK 细胞扩增实验。

结果

图1：从人实体器官样本中扩增NK细胞的示意图。 简言之，获取的人肝脏样本被剪切成小块以进行机械消化。随后使用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包被的二氧化硅和淋巴细胞分离介质分离解离的细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原酶 IV	Sigma	C4-22-1G	用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的分离
不含钙和镁的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）	ThermoFisher	14170120	用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的分离
淋巴细胞分离液	Corning	25-072-CV	用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的分离
磷酸盐缓冲液（PBS）	Corning	21-040-CV	用于转导
R-10 培养基<br/> 成分：RPMI 1640	VWR	45000-404
R-10 培养基<br/> 成分：L-谷氨酰胺	VWR	45000-304	1%
R-10 培养基<br/> 成分：青霉素-链霉素	VWR	45000-652	1%
R-10 培养基<br/> 成分：胎牛血清（FBS）	Corning	35-010-CV	10%