从外周血单个核细胞中进行自然杀伤细胞的体外扩增

摘要

来源：Ma, M., 等. 利用膜结合型IL-21修饰的B细胞系扩增自然杀伤（NK）细胞和CAR-NK细胞的方法。视觉化实验杂志 (2022)。

本视频展示了一种利用饲养细胞系直接从外周血单个核细胞（PBMCs）扩增自然杀伤（NK）细胞的技术。将PBMCs与经基因修饰、表达膜结合型白细胞介素-21（mIL-21）的淋巴母细胞样饲养细胞共培养，并在培养体系中添加细胞因子白细胞介素-2（IL-2）和白细胞介素-15（IL-15）。这种配体组合可实现高纯度NK细胞的长期扩增。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际有关人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 从小鼠肝脏组织中扩增自然杀伤细胞（第0天），如图1所示。

注意：初始细胞数量和存活率与器官摘除后的时间以及初始组织样本量密切相关。然而，如果将组织置于30 mL的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，并在冰上或4 °C冰箱中过夜保存，则自然杀伤细胞（NK细胞）仍可在24小时后以高纯度和高存活率进行扩增。

1. 使用无菌外科器械识别可存活的组织区域，以从中获取淋巴细胞。
2. 将组织置于 30 mL HBSS（不含钙或镁）中，并置于冰上保存，直至准备进行分离处理。
3. 在生物安全柜内，使用无菌剃刀片或剪刀和镊子将组织切成 <0.5 cm 的小块。
4. 通过将 10x 储存液用 HBSS 稀释，配制 1x 胶原酶 IV 溶液（1 mg/mL）（10x 胶原酶 IV：10 mg/mL 或约 200 U/mL）。
5. 将切碎的组织块放入组织解离管中。每管组织量不超过 4 g，并用约 10 mL 1x 胶原酶 IV 浸没组织块。
   注意：不建议使用 DNase I，因其可能轻微降低 NK 细胞的存活率和得率。有关所用特定组织解离管的信息，请参见材料表。
6. 将组织解离管放入组织解离仪中，在 37 °C 下充分搅拌以彻底解离组织。
   注意：肝脏组织可能需要超过 30 分钟；对于更易碎的组织，约 15 分钟即可。有关所用特定组织解离管和组织解离仪的信息，请参见材料表。
7. 取出组织解离管，用 5 mL 注射器尾端将悬液反复吹打并通过 40 µm 尼龙细胞筛网过滤。收集滤出液，弃去未消化的大块组织碎片。
8. 在室温下以 400 x g 离心 5 分钟，沉淀细胞。吸除上清液。
9. 将细胞沉淀重悬于 30% 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包被的二氧化硅中，以去除可能污染最终淋巴细胞组分的脂肪细胞。
   1. 配制 1x PVP 包被的二氧化硅：将 PVP 包被的二氧化硅用 10x PBS 按 9:1 比例稀释。
      注意：有关所用特定 PVP 包被二氧化硅的信息，请参见材料表。
   2. 配制 30% PVP 包被的二氧化硅：将 1x PVP 包被的二氧化硅用 PBS/HBSS 稀释。
10. 在室温下以 400 x g 离心 5 分钟，沉淀细胞。吸除上清液。
11. 将细胞沉淀重悬于 9 mL R-10 培养基中。
    注意：有关 R-10 培养基成分的信息，请参见材料表。
12. 小心地将细胞悬液叠加于 4 mL Ficoll 或淋巴细胞分离液上，以分离淋巴细胞与红细胞及多形核细胞。
13. 在室温下以 400 x g 离心 23 分钟，加速度和刹车关闭或调至最低档，以分离各层。小心倾去上层培养基，收集含有组织浸润性淋巴细胞的界面层。
14. 用 10 mL 培养基洗涤细胞，随后进行细胞计数、流式细胞术分析、分装、冻存，或进行原代 NK 细胞扩增实验。

2. 从外周血单个核细胞（或脐带血或器官组织）中扩增原代NK细胞（第0天），如图2所示。

1. 在37 °C水浴中解冻冻存的外周血单个核细胞（PBMC）和冻存的经照射的饲养细胞。
2. 分别将PBMC和100 Gy照射的221-mIL-21细胞用10 mL R-10培养基在400 × g 离心5分钟进行洗涤。
3. 保留1 × 10⁶个PBMC细胞用于流式细胞术检测。
   注意：初始NK细胞纯度是计算NK细胞扩增率的重要因素。
4. 将细胞重悬于1 mL R-10培养基中，使用台盼蓝染色法进行细胞计数。
5. 在特制的6孔板中（见材料表），将5 × 10⁶个PBMC细胞与10 × 10⁶个100 Gy照射的221-mIL-21细胞混合。
6. 加入30 mL R-10培养基，并添加人IL-2（200 U/mL）和人IL-15（5 ng/mL）（见材料表）。
7. 将特制6孔板置于37 °C、5% CO₂条件下培养。
8. 每3–4天更换一次培养基，使用添加人IL-2（200 U/mL）和人IL-15（5 ng/mL）的R-10培养基以维持NK细胞生长。
   注意：每次换液时，每孔细胞数应维持在20 × 10⁶个以下，以利于进一步扩增；为获得最佳存活率，确保每孔总细胞数不超过100 × 10⁶个。
9. 每3–4天记录总细胞数和细胞存活率，并进行流式细胞术分析，以计算NK细胞扩增率。

结果

图1：从人实体器官样本扩增NK细胞的示意图。 简而言之，获取的人肝脏样本被切成小块以进行机械消化。随后使用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包被的二氧化硅和淋巴细胞分离介质分离解离的细胞。进一步地，采用图2中所述的扩增方案对NK细胞进行扩增。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔G-REX培养板	Wilson Wolf	80240M	用于NK细胞扩增
AF647标记的AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	109-606-088	用于流式细胞术
IV型胶原酶	Sigma	C4-22-1G	用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分离
冻存培养基	Corning	35-010-CV	90%
成分：胎牛血清（FBS）
冻存培养基	Sigma	D2050	10%
成分：二甲基亚砜（DMSO）
gentleMACS C管	Miltenyi Biotec	130-093-237	用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分离
gentleMACS Octo	Miltenyi Biotec	Quote	用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分离
不含钙和镁的Hank's平衡盐溶液（HBSS）	ThermoFisher	14170120	用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分离
人IL-15	Peprotech	200-15	用于NK细胞扩增
人IL-2	Peprotech	200-02	用于NK细胞扩增
经辐照的221-mIL21饲养细胞	由刘东芳博士实验室制备		使用冻存培养基冻存
淋巴细胞分离液	Corning	25-072-CV	用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分离
PE标记的抗人CD3单克隆抗体（克隆HIT3a）	Biolegend	300308	用于流式细胞术
PE/Cy7标记的抗人CD56（NCAM）单克隆抗体（克隆5.1H11）	BioLegend	362509	用于流式细胞术
Percoll	GE Healthcare	17089101	用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分离
外周血单个核细胞（PBMCs）	纽约血液中心		从健康供体血浆中分离，使用冻存培养基冻存
R-10培养基	VWR	45000-404
成分：RPMI 1640
R-10培养基	VWR	45000-304	1%
成分：L-谷氨酰胺
R-10培养基	VWR	45000-652	1%
成分：青霉素-链霉素
R-10培养基	Corning	35-010-CV	10%
成分：胎牛血清（FBS）
台盼蓝	Corning	25-900-Cl	用于细胞计数