辅助T细胞与抗原呈递细胞之间免疫突触的形成

摘要

来源：Bello-Gamboa, A. 等，人类免疫突触成像 J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用荧光显微镜在体外研究抗原呈递细胞与辅助性T淋巴细胞之间免疫突触形成的实验方法。辅助性T淋巴细胞的T细胞受体与抗原呈递细胞表面的抗原-MHC-II复合物相互作用，形成免疫突触，随后分泌性囊泡向该突触区域移动，这一过程可通过荧光显微镜观察到。

方案

1. 准备用于黏附Raji细胞的载玻片

1. 向8孔塑料底培养板的每个孔中加入150 µL纤连蛋白（100 µg/mL），在37 °C孵育30分钟至1小时。该黏附基质可促进Raji细胞与孔底的结合（步骤2）、与Jurkat细胞形成活细胞共轭体（步骤4），以及进行延时显微成像（步骤6），并且后续还可兼容可选的多聚甲醛（PFA）固定。 
   注意： 若采用丙酮固定，请使用玻璃底培养板并以多聚-L-赖氨酸（20 µg/mL）替代纤连蛋白，因为丙酮会溶解塑料。8孔培养板（每孔1 cm² ，最大体积300 µL）或同等规格产品是一种灵活且合适的选择。
2. 使用200 μL自动移液器吸除纤连蛋白溶液，每孔加入200 µL PBS，在轻微振荡条件下洗涤2分钟，重复洗涤一次。此阶段的培养板可在4 °C下用PBS保存1–2周。

2. Raji 细胞在载玻片上的黏附及7-氨基-4-氯甲基香豆素（CMAC）标记

1. 将10 mL对数生长期的Raji细胞预培养液（浓度为1-2 × 10⁶ 个细胞/mL）转移至15 mL V型底离心管中，充分混匀后取10 µL，在血细胞计数板（如Neubauer计数板）或同等设备上进行细胞计数。
2. 将剩余细胞在室温下以300 × g 离心5分钟，吸除并弃去上清液。
3. 用预热的完全培养基（RPMI 1640，添加10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、10 mM HEPES、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）轻柔重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至10⁶ 个细胞/mL。使用以下公式进行计算：
   （[ ]_初始 × V_初始  = [ ]_最终  × V_最终），其中[ ]_初始 表示初始细胞浓度，V_初始 为细胞悬液初始体积，[ ]_最终 为最终细胞浓度，V_最终 为细胞悬液最终体积。
   注意： 根据起始培养物的细胞浓度，可能收集到超过所需数量的细胞，但必须将剩余细胞继续在37 °C培养至实验结束，以避免潜在问题（见步骤2.6）。
4. 对标记Raji细胞以在突触连接体形成过程中进行识别。本实验中，Raji细胞在步骤2.4.2中使用7-氨基-4-氯甲基香豆素（CMAC）进行标记。
   1. 将所需数量的Raji细胞连同培养基转移至2 mL离心管中。对于8孔腔室载玻片，共需1.6 mL细胞悬液（每孔200 µL）。
   2. 加入CMAC至终浓度为10 µM。由于CMAC对光敏感，需用铝箔包裹离心管以避光保存。每1 cm² 孔需含2 × 10⁵ 个Raji细胞的悬液200 µL。因此，若需准备8个孔，则共需1.6 × 10⁶ 个Raji细胞。
      注意： 使用细胞示踪染料蓝色（CMAC，紫外激发，蓝色发射）标记Raji细胞，可在突触连接体形成时将其与Th细胞区分开。该染料与多聚甲醛（PFA）和丙酮固定剂兼容，适用于后续免疫荧光操作。应尽量避免光照。将Raji细胞集中用CMAC标记后再重悬，并在接种至纤连蛋白包被的腔室载玻片前进行，可确保不同孔间Raji细胞的CMAC标记均匀一致。
5. 重悬CMAC染色的细胞，在步骤1.2中吸除腔室载玻片内的PBS后，将200 µL细胞悬液加入已制备好的纤连蛋白包被的腔室载玻片各孔中。将腔室载玻片置于37 °C、5% CO₂ 条件下孵育30分钟至1小时。
   注意： 此步骤中细胞黏附与CMAC标记可同时完成，节省时间。请注意Raji细胞沉降迅速，接种前需轻柔混匀以维持细胞悬液浓度均一。此阶段无需通过离心洗涤CMAC，因CMAC的洗涤可在步骤2.7中更方便地进行（此时标记的Raji细胞已黏附于腔室载玻片）。由于CMAC在细胞悬液中过量存在，背景蓝色荧光过高，难以分辨染色细胞。应在步骤2.7完成CMAC洗涤后，再通过荧光显微镜检查细胞的CMAC荧光信号。
6. 通过在显微镜下轻柔晃动腔室载玻片，确认Raji细胞已黏附于孔底。确保细胞之间存在间隙，未达到汇合状态（图1，中间图）。细胞汇合度在50–60%为宜。
   1. 若大多数细胞已有效黏附于腔室载玻片且无细胞间隙，可用预热的完全培养基轻轻洗涤各孔，并用200 μL移液器吹打重悬以去除过多细胞。每次重悬后检查汇合度。
   2. 若细胞未充分黏附，可重复黏附步骤，并延长黏附时间和/或增加细胞数量。
      注意： 可在此处暂停，将腔室载玻片置于37 °C、5% CO₂ 条件下过夜（O/N），次日继续实验流程。次日需通过荧光显微镜确认Raji细胞仍保持黏附状态且CMAC标记有效。
7. 再次用预热的含补充成分的RPMI培养基小心洗涤各孔，以去除多余的CMAC，并使用荧光显微镜观察蓝色荧光发射情况（图1）。
   注意： 为避免使用浸油（黏稠且易残留）及高数值孔径的油镜，可选用超长工作距离物镜（如20×或40×）通过荧光显微镜快速检查CMAC标记效果。

3. 使用金黄色葡萄球菌肠毒素E脉冲标记CMAC的Raji细胞

1. 向每个孔中加入金黄色葡萄球菌肠毒素 E（SEE，1 µg/mL）。可将 SEE 从冷冻储备液（PBS 中 1 mg/mL）用细胞培养基稀释成工作液（100 µg/mL），方便使用。每 200 μL 微孔使用 2 μL 的 100 倍工作液。
   注意： 此步骤需佩戴手套，并将使用过的枪头丢弃至生物危害废物盒中。
2. 将培养腔室载玻片在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育至少 30 分钟。SEE 的作用可持续至少 3–4 小时。
   备注： 若计划采用不同的时间序列设置（步骤 5）和/或根据终点实验的起始时间点（步骤 6），可在不同时间点向孔中添加 SEE。

4. Jurkat 细胞的制备

1. 使用先前培养的Jurkat细胞（1-2 × 10⁶ 个细胞/mL）进行本实验。可使用来自标准培养瓶的细胞，或根据前述方法，在标准电穿孔转染后获得的细胞。对Jurkat细胞进行转染可实现活细胞中分泌颗粒运输过程的延时成像观察。例如，当表达GFP-CD63（MVB的标记物）时，可记录GFP-CD63标记囊泡的运动情况。
2. 在相差显微镜下观察细胞。若发现大量死亡细胞（>20–30%），则在使用前采用标准方案进行Ficoll密度梯度离心，以去除过多的死亡细胞（死亡细胞密度高于活细胞）（参见讨论部分）。
3. 将细胞转移至15 mL V型底离心管中，并取10 µL使用血细胞计数板进行细胞计数。
4. 按照步骤2.2所述方法离心剩余细胞。弃去上清液，并用新鲜预温的培养基将细胞重悬至与Raji细胞相同的浓度（1 × 10⁶/mL）。随后执行步骤2.2–2.3。
5. 在等待步骤4期间，将Jurkat细胞继续在培养箱中维持培养（37 °C，5% CO₂）。
   注意： 在第二种方案（转染）中，活细胞数量将显著低于第一种方案。因此，建议使用更大的起始培养体积，以确保实验所需足够数量的细胞。每次电穿孔转染使用约10 × 10⁶ 个Jurkat细胞，转染48小时后仅约有2–4 × 10⁶ 个细胞存活，且部分细胞将在Ficoll分离步骤中丢失。因此，通常一个电穿孔杯所提供的转染后Jurkat细胞数量足以用于刺激8个微孔中贴壁的SEE脉冲处理Raji细胞（需1.6 × 10⁶ 个转染的Jurkat细胞）。

Raji 细胞与 Jurkat 细胞的共接种

1. 从第3.2步的培养箱中取出含有CMAC标记、SEE脉冲处理并已贴壁的Raji细胞的腔室载玻片。此阶段无需洗涤CMAC，因为该步骤已在第2.7步中完成。
2. 使用自动200 μL移液器，从每个孔的一角开始，逐一小心吸除各孔中的培养基。注意不要让孔内的培养基完全干燥。
3. 立即用200 µL在第4.5步中制备的重悬Jurkat细胞（细胞培养基中浓度为1 × 10⁶/mL）替换原有培养基。如果进行延时成像，请在此步骤后立即进入第6步，因为Jurkat细胞沉降迅速，并很快形成突触连接。为方便起见，此阶段未接种Jurkat细胞的、含有SEE脉冲处理并已贴壁的Raji细胞微孔，应继续维持在细胞培养基中，直至后续接种Jurkat细胞。这可灵活支持后续进行额外的延时成像、反向动力学或终点实验分析。
4. 若计划进行延时成像，应迅速进入第6步。此步骤包括在显微镜载物台培养箱或等效设备中于37 °C、5% CO₂ 条件下共培养1–2小时，以允许突触连接形成并同时进行图像采集。若仅进行终点分析而不进行延时成像，则应在共培养结束后先使用显微镜检查连接形成情况（如 图1所示），再进行细胞固定。

6. 突触连接形成的延时成像

1. 成像前准备显微镜和培养孵育室。本示例的详细显微镜设置见 图2。
   注意： 若计划进行延时成像实验，在将Jurkat细胞悬液加入已贴壁Raji细胞的腔室载玻片前，应提前准备好所有显微镜设置及相关配件（如细胞培养环境舱等）。以下步骤以商用显微镜为例进行描述（见材料表），但任何配备细胞培养孵育箱的倒置荧光显微镜均可使用。
   1. 成像极化运输过程时，应使用配备60倍油镜且数值孔径较高的显微镜。
   2. 确保自动对焦系统已开启，并调整偏移量以聚焦贴附于腔室底部的Raji细胞。请参见 图1。
2. 在步骤5.3中将Jurkat细胞加入含有已贴壁Raji细胞的各孔后，迅速将腔室载玻片置于预热（1–2小时）的显微镜载物台孵育器（例如OKOlab）上，并使用显微镜选择若干XY位置，优先选取可能记录到免疫突触（IS）初始形成过程的视野，例如一个转染的Jurkat细胞进入显微镜焦平面的区域。
3. 应使用预热的显微镜载物台孵育器，因为温度稳定的载物台有助于维持X、Y、Z方向位置的稳定性。理想的XY视野应满足以下条件：Raji细胞聚焦清晰且未过度融合（即细胞间存在间隙），并可见转染的Jurkat细胞（可通过透射光与紫外光或GFP通道联合观察确认）。Jurkat细胞在腔室载玻片上沉降速度极快（数分钟内），随着时间推移，捕获新生突触形成事件的概率将逐渐降低（图1）。实验可在预定的延时成像结束后终止，或继续进行步骤7，固定细胞结合体以进行后续免疫荧光染色与分析。
   注意： 借助适当的时序分辨率（每帧1–2分钟），可同时对最多4个不同微孔中的多达16个不同显微视野进行多孔延时成像采集。该限制主要取决于所成像的不同荧光染料的数量及其强度（影响相机曝光时间），而荧光染料数量又取决于除CMAC外表达的荧光蛋白种类。提高帧率的一种方法是：对于CMAC通道，仅在每“n”帧GFP图像中采集一次（例如n = 8，见 图2），因为Raji细胞已贴附于孔底，不像Jurkat细胞那样容易移动。此外，该策略有利于维持细胞活力，因为频繁的紫外光照射可能对细胞造成损伤。建议将成像时间间隔调整为每分钟1帧或更短（例如每帧20秒， 图2），因为多泡体（MVB）的极化过程通常需要数分钟至数小时才能完成。进行此类多通道成像时，显微镜必须配备电动落射荧光转盘及合适的带通荧光滤光片或等效组件。

结果

图1展示了按照本实验方案（步骤5.2）获得的Jurkat-Raji突触结合物。该图像来自一个代表性的时间推移实验的第一帧。在1 cm² 孔中加入2 × 10⁵ 个Raji细胞和2 × 10⁵ 个Jurkat细胞。上图显示透射光通道，中图显示CMAC（蓝色）通道（Raji细胞），下图显示透射光与CMAC通道的叠加图像。黄色箭头标示了一些典型的突触结合物作为参考，绿色箭头指示由一个Jurkat细胞与多个Raji细胞形成的突触结合物（复杂结合物）。降低细胞浓度（在1 cm² 孔中为10⁵ 或更少细胞）可避免复杂细胞结合物的形成，但可能导致后续极化运输...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
尼康 DS-QI1MC 相机	Nikon	MQA11550	制冷相机头
CMAC	ThermoFisher Scientific	C2110	细胞示踪蓝色染料
JURKAT 细胞	ATCC	ATCC TIB-152	效应性 T 淋巴细胞
μ-Slide 8 孔 ibiTreat，μ-Slide 8 孔玻璃底板	IBIDI	Cat.No: 80826, 80827	细胞培养与细胞成像载体
配备三通道手动气体混合器及气体鼓泡/湿度模块的显微镜载物台培养箱	OKOLAB	H201-NIKON-TI-S-ER	细胞培养环境控制装置
Raji 细胞	ATCC	ATCC CCL-86	抗原呈递细胞（APC）
RPMI 培养基 GIBCO	ThermoFisher Scientific	21875034	培养基
Streptococcus 肠毒素 E（SEE）	Toxin Technology, Inc	EP404	细菌毒素
Image J 软件	NIH	Image J	图像处理软件
Nikon NIS-AR 软件	Nikon	NIS-Elements AR	图像采集与分析软件