流式细胞术检测人细胞因子诱导的杀伤细胞CD标志物识别

摘要

来源：Hsiao, C. H.，等。用于癌症治疗的细胞毒性细胞因子诱导杀伤性T细胞的分离与扩增。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们演示了一种基于流式细胞术的技术，用于测定由外周血单个核细胞培养扩增出的细胞因子诱导的杀伤性T细胞（CIK细胞）的比例。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. CIK 细胞的诱导与扩增

1. 第0天，在37 °C、5% CO₂的湿润化细胞培养箱中，将PBMCs（1 × 10⁶）接种于含1,000 IU/mL IFN-γ的新鲜基础培养基中，培养24小时。
2. 第1天，更换为含50 ng/mL抗CD3抗体、1 ng/mL rh IL-1α和1,000 U/mL rh IL-2的新鲜基础培养基。此后每3天更换一次培养基。
3. 第7天，更换为含1,000 U/mL rh IL-2的新鲜基础培养基。此后每3天更换一次培养基，直至细胞扩增结束（第14天）。

2. 用于评估CIK细胞的免疫表型分析

1. 用10 mL无菌PBS洗涤CIK细胞，在300 × g、18−20 °C条件下离心10分钟，吸除上清液，再用10 mL PBS重悬细胞。用台盼蓝排斥法计数细胞数量并检测细胞活力。
2. 将CIK细胞分装至六个无菌的1.5 mL离心管中，每管细胞密度约为5–10 × 10⁵ 个细胞/mL PBS。标记并按如下处理：第1管为空白对照（不加抗体）；第2管加入20 µL同型对照IgG1-FITC；第3管加入20 µL同型对照IgG1-APC单克隆抗体；第4管加入20 µL CD3-FITC；第5管加入20 µL CD56-APC单克隆抗体；第6管同时加入20 µL CD3-FITC和20 µL CD56-APC单克隆抗体。
3. 用1 mL无菌移液器轻轻吹打至少3次，使CIK细胞与抗体充分混匀，然后在室温避光条件下孵育30分钟。
4. 在300 × g、18−20 °C条件下离心10分钟，吸除上清液，用1 mL PBS重悬细胞沉淀，再用1 mL无菌移液器轻轻吹打至少3次。
5. 重复步骤2.4。
6. 流式细胞术分析前将各管保持避光状态。

3. CD 标记物识别

1. 用移液器轻轻将细胞悬液通过滤帽转移至无菌的5 mL聚苯乙烯圆底管中（滤帽孔径为100 μm）。将试管按顺序放置在进样架上。
2. 打开流式细胞仪分析软件，创建一个实验文件夹。点击新建样本按钮，向实验中添加样本和试管，并按以下方式命名试管：试管1，空白；试管2，同型对照IgG1-CD3；试管3，同型对照IgG1-CD56；试管4，CD3；试管5，CD56；试管6，CD3CD56。
3. 为CIK细胞群体建立散点图设门系统（图1A）。
   1. 选择试管1（空白），点击点图按钮，生成FSC-A/SSC-A图。在FSC-A阈值>5 x 10⁴ 的条件下，围绕整个细胞群体绘制矩形门，以排除细胞碎片。
   2. 为新点图选择SSC-A/SSC-H参数，并围绕所有单细胞绘制多边形门。分别为新直方图选择Count/FITC (CD3)和Count/APC (CD56)参数。为新点图选择FITC (CD3)/APC (CD56)参数，并绘制四象限门以定义四个亚群。
   3. 记录每个样本中20,000个单细胞的数据。点击加载样本按钮，首先分析空白对照样本。利用CD56和CD3通道参数识别完整的CIK细胞群体。
4. 对所有样本的检测重复步骤3.3。
5. 打开包含各样本统计数值的文件，用于分析CIK细胞群体，并将其重新导出至分析文件中。

结果

图1：来自一个代表性外周血单个核细胞（PBMC）样本的CD3⁺CD56⁺ T细胞比例。（A）通过特定的细胞大小和颗粒度识别淋巴细胞。选择单细胞群体用于流式细胞术分析。（B）使用t检验对来自三位健康供体的CIK细胞扩增效率进行统计学分析（*，p < 0.01）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC 小鼠抗人 CD56 抗体	BD	555518	B159
APC 小鼠 IgG1，κ 同型对照	BD	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II 流式细胞仪	BD	338962	序列号：R33896202856
DMEM/F12 培养基（杜氏改良伊格尔培养基/F12）	HyClone	SH30023.02	OC-3 细胞培养的基础培养基
胎牛血清	HyClone	SH30084.03	用于 K562 和 OC-3 细胞培养。完全培养基中含 10% 胎牛血清
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	71101700-EK	密度梯度分离液
FITC 小鼠抗人 CD3 抗体	BD	555332	UCHT1
FITC 小鼠 IgG1，κ 同型对照	BD	555748	MOPC-21
人抗 CD3 单克隆抗体	TaKaRa	T210	OKT3<br/> 取 2.5 mL 原液（1 mg/1 mL）加入 50 mL 诱导培养基中。原液储存于 -80 &deg;C
RPMI1640 培养基	Gibco	11875-085	K562 细胞培养的基础培养基。原液储存于 4 &deg;C