小鼠淋巴器官中干扰素-γ分泌的检测方法

摘要

来源：Mazet, J. M., 等. 小鼠脾脏中原位干扰素γ产生的成像 单核细胞增生李斯特菌 感染。 视频实验杂志 (2019).

本视频演示了一种用于可视化成像的方法 原位 小鼠脾脏中干扰素-γ（IFN-γ）的分泌。在细菌感染后，T细胞和自然杀伤细胞内IFN-γ积累被诱导，随后从小鼠体内取出脾脏。获取组织切片后，通过免疫染色对细胞内IFN-γ进行可视化检测。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠中抗原特异性CD8+ T细胞的过继转移

1. 使用小鼠 CD8⁺ T 细胞分离试剂盒，按照制造商说明书从 T 细胞受体转基因小鼠的淋巴结悬液中分离表达绿色荧光蛋白（OTI-GFP）或红色荧光蛋白（OTI-RFP）的卵清蛋白（OVA）特异性 CD8⁺ T 细胞（OTI）。通过注射器活塞碾压淋巴结制备细胞悬液，方法如前所述。
2. 通过静脉注射将 OTI-GFP 或 OTI-RFP 细胞（3 × 10⁶ 个细胞）转移至 C57BL/6 野生型小鼠受体中，操作方法参照 Cahalan 等人的描述。通常使用 6–12 周龄的小鼠。
   注意：此步骤为可选步骤，仅在需要追踪抗原特异性 CD8⁺ T 细胞时才需进行。

2. Listeria monocytogenes 感染

1. 展开 L. monocytogenes 在37 °C、轻度振荡条件下，在肉汤心浸液中将经基因改造以表达OVA的单核细胞增生李....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
布雷菲尔德菌素A	剑桥生物科学	CAY11861
多聚甲醛	Agar 科学	R1018
L-赖氨酸二盐酸盐	Sigma生命科学	L5751
偏高碘酸钠	Thermo Scientific	20504
D(+)-蔗糖	VWR 化学品	27480.294
精密擦拭纸 Kimtech 科学	金佰利专业	75512
O.C.T. 包埋剂，冷冻切片用封固介质	VWR 化学品	361603E
Fc阻断剂，纯化抗小鼠CD16/32，克隆93	Biolegend	101302	抗体克隆及使用浓度： 2.5 mg/ml
显微镜载玻片 - Superfrost Plus	VWR 化学品	631-0108
抗-CD169 - AF647	Biolegend	142407	抗体克隆及使用浓度： 克隆 3D6.112 1.6 mg/ml
			激发波长： 650
			发射波长： 65
抗-F4/80 - APC	Biolegend	123115	抗体克隆及使用浓度： 克隆 BM8 2.5 mg/ml
			激发波长： 650
			发射波长： 660
抗-B220 - PB	Biolegend	103230	抗体克隆及使用浓度： 克隆 RA3-6B2 1.6 mg/ml
			激发波长： 410
			发射波长： 455
抗-IFNγ - 生物素	Biolegend	505804	抗体克隆及使用浓度： 克隆 XMG1.2 5 mg/ml
抗-IFNγ - BV421	Biolegend	505829	抗体克隆及使用浓度： 克隆 XMG1.2 5 mg/ml
			激发波长： 405
			发射波长： 436
抗-Nkp46/NCRI	R&D Systems	AF2225	抗体克隆及使用浓度： 山羊 2.5 mg/ml
抗山羊IgG-FITC	Novusbio	NPp 1-74814	抗体克隆及使用浓度： 1 mg/ml
			激发波长： 490
			发射波长： 525
链霉亲和素 - PE	Biolegend	405203	抗体克隆及使用浓度： 2.5 mg/ml
			激发波长： 565
			发射波长： 578
链霉亲和素 - FITC	Biolegend	405201	抗体克隆及使用浓度： 2.5 mg/ml
			激发波长： 490
			发射波长： 525
Fluoromount G	南方生物技术	0100-01
盖玻片 22x40mm	Menzel-Glazer	12352128
液体阻断剂 Super PAP PEN mini	Axxora	CAC-DAI-PAP-S-M
Imaris - 显微图像分析软件	Bitplane
共聚焦显微镜 - Olympus FV1200 激光扫描显微镜	Olympus
冷冻切片机 - CM 1900 UV	Leica
一次性基底模具	费舍尔科学英国有限公司	11670990
PBS 1X	Life Technologies Ltd	20012068
BHI 肉汤	VWR 品牌	303415ZA
GFP			激发波长： 484
			发射波长： 507
RFP			激发波长： 558
			发射波长： 583
胰岛素注射器，带针头，29G	VWR 国际	BDAM324824
C57BL/6 野生型小鼠	查尔斯河