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所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 小鼠中抗原特异性CD8+ T细胞的过继转移
- 使用小鼠 CD8+ T 细胞分离试剂盒，按照制造商说明书从 T 细胞受体转基因小鼠的淋巴结悬液中分离表达绿色荧光蛋白（OTI-GFP）或红色荧光蛋白（OTI-RFP）的卵清蛋白（OVA）特异性 CD8+ T 细胞（OTI）。通过注射器活塞碾压淋巴结制备细胞悬液，方法如前所述。
- 通过静脉注射将 OTI-GFP 或 OTI-RFP 细胞（3 × 106 个细胞）转移至 C57BL/6 野生型小鼠受体中，操作方法参照 Cahalan 等人的描述。通常使用 6–12 周龄的小鼠。
注意：此步骤为可选步骤，仅在需要追踪抗原特异性 CD8+ T 细胞时才需进行。
2. Listeria monocytogenes 感染
- 展开 L. monocytogenes 在37 °C、轻度振荡条件下，在肉汤心浸液中将经基因改造以表达OVA的单核细胞增生李斯特菌（LM-OVA）培养至对数生长期，直至OD600达到0.08–0.1，方法如前所述。
- 通过29 G胰岛素注射器，将100 µL（最大体积为200 µL）用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释的0.1–0.5 LD50 LM-OVA，静脉注射至携带OTI-GFP或OTI-RFP细胞的C57BL/6野生型小鼠受体中（按指示进行）。
注意： 在我们实验室，0.1 x LD50 LM-OVA 相当于 2 x 104 菌落形成单位（CFU） L. monocytogenes 经遗传修饰以表达OVA的细胞用于激活先前转移的OTI CD8+ T细胞，但其他品系的 L. monocytogenes 可以使用。
3. 使用布雷菲德菌素A（BFA）处理以阻断细胞因子分泌
- 使用29 G胰岛素注射器，在小鼠处死前6小时，以200 µL PBS溶液腹腔注射250 µg布雷菲德菌素A（BFA）。
注意：冻干的BFA首先用二甲基亚砜（DMSO）重悬，配制成25 mg/mL的储存液。然后在室温（RT）下用PBS稀释，以避免注射前发生结晶。抑制细胞因子分泌可导致IFNγ在细胞内积聚，这对细胞因子的检测至关重要。
4. 脾脏的采集
- 采用逐渐增加浓度的 CO2 对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
注意：应遵循当地机构关于人道处死小鼠的指导原则。
- 用 70% 乙醇清洁腹部，使用剪刀在小鼠左侧 flank（脾脏所在位置）皮肤上做 1–2 cm 的切口。小心切开腹膜以暴露脾脏，并用镊子取出脾脏。采集脾脏时需注意避免使用镊子用力挤压或切割，以防破坏脾脏结构。
5. 使用多聚甲醛（PFA）固定脾脏
- 通过混合 3.75 mL PBS 和 3.75 mL 0.2 M L-赖氨酸来配制固定液。加入 21 mg 高碘酸钠并充分混匀，然后加入 2.5 mL 4% 多聚甲醛（PFA）和 20 µL 12 N NaOH。
注意：固定液需当天配制并使用，多余部分应丢弃，不可储存。如果样品中含有 GFP 等荧光蛋白，此固定步骤尤为重要。请勿使用含有甲醇残留的 PFA，因其会变性荧光蛋白。
注意：PFA 具有毒性，操作时须谨慎。
- 将脾脏完全浸入固定液中，于 4°C 轻柔振荡条件下固定至少 4 小时，通常为 16–20 小时。
- 弃去固定液，加入 5 mL PBS，在室温下轻柔振荡洗涤 5 分钟。
- 更换为 5 mL 新鲜 PBS，于 4 °C 轻柔振荡孵育 1 小时。
- 用 5 mL 30% 蔗糖溶液替换 PBS，并孵育 12–24 小时。
注意：该方法有助于维持组织形态。经蔗糖溶液孵育后，器官应沉降至孔板底部。
6. 冷冻与切片
- 将干冰放入一个较大的容器中，并在其中放置一个较小的容器，内含约 50 mL 纯甲醇和几块干冰。
- 用无绒布轻轻擦干脾脏。
- 将脾脏放入底部含有少量最佳切割温度（OCT）包埋剂的底模中，注意避免产生气泡。然后在脾脏上方再添加 OCT 包埋剂。
- 用镊子将底模放置在甲醇液面上，确保底模不接触 OCT 包埋剂，以尽可能快速地冷冻组织，从而减少组织损伤。
- 当组织完全冻结后，即可进行切片。
注意：冷冻后的脾脏可在 -80 °C 下保存数月。
- 使用冷冻切片机对组织进行切片。
- 将恒温冷冻切片机的腔室温度设为 -21 °C，切取所需厚度的切片（通常约为 10 µm）。本方案适用于厚度不超过 30 µm 的切片。
- 将切下的组织切片转移至玻璃载玻片上（参见材料表），并进行肉眼检查。
注意：切片可在 -80 °C 下保存数月。
7. 免疫荧光染色
- 将切片置于室温下平衡。
- 使用液体阻隔笔（例如 PAP 笔）在组织切片周围画一个圆圈。画圈时应位于 OCT 包埋介质之外，否则无法有效封闭。
- 待液体阻隔圈干燥后，通过在组织切片上加入 PBS 溶液 5 分钟以重新水化样本。
注意：加入切片上的液体体积取决于切片大小，通常使用 100–300 µL。切片一旦开始水化后，切勿让其干燥。
- 用 PBS 至少清洗两次，确保切片牢固地附着于载玻片上。
- 向切片中加入封闭液，以减少抗体的非特异性结合。
- 按以下方法配制封闭液：PBS 中含 0.1% Triton X-100、2% 胎牛血清（FCS）和 2.5 µg/mL Fc 受体阻断剂（抗小鼠 CD16/32）。然后根据染色方案中每种二抗的来源物种，加入相应物种的正常血清至终浓度为 2–5%。
注意：若抗体为直接偶联或生物素标记的，应加入每种一抗来源物种的正常血清至终浓度为 5%。若一抗与某一二抗来源于同一物种（例如，一抗为兔源，二抗为兔抗大鼠），则不应使用该物种的正常血清，以免增加背景信号。
- 轻轻吸去切片上的 PBS，每张样本切片加入 100 µL 封闭液。在加盖的湿盒中，室温孵育至少 1 小时。
- 使用一抗进行染色。
- 用封闭液将一抗稀释至最佳浓度。一般起始浓度为 5 µg/mL，但需根据每种抗体和组织类型进行优化。
注意：若抗体为直接偶联的，使用前需将抗体混合液在 4 °C 下以 17.135 × g（13,500 rpm）离心 15 分钟。荧光染料可能发生沉淀，此步骤可使沉淀物沉降，从而防止其非特异性沉积在载玻片上。
- 将每张样本的封闭液替换为一抗混合液。
- 在加盖的湿盒中，室温孵育 4 小时或 4 °C 过夜（OVN）。
- 进行洗涤。
- 通过向 PBS 中加入 2% FCS 配制洗涤缓冲液。
- 用洗涤缓冲液洗涤 4 次：第一次快速洗涤（不孵育），第二次 10 分钟，第三和第四次各 5 分钟。最后用 PBS 洗涤 5 分钟。
- 使用二抗进行染色。
- 用封闭液将目标二抗稀释至最佳浓度。混合液的离心步骤参照一抗处理方法进行。
- 吸去最后一次洗涤液，将二抗混合液加至切片上，在加盖的湿盒中室温孵育 1–4 小时。
- 用洗涤缓冲液洗涤 4 次：第一次快速洗涤（不孵育），第二次 10 分钟，第三和第四次各 5 分钟。最后用 PBS 洗涤 5 分钟。
- 吸去最后一次洗涤液，让 PBS 自然挥发，但避免切片过度干燥。在样本上滴加一滴封片剂，小心地将盖玻片覆盖其上。封片剂应完全覆盖整个组织区域。在避光条件下室温静置，使其过夜聚合。
注意：在加封片剂前，可在载玻片背面的切片周围画一圈标记。一旦加入封片剂后，组织可能变得难以观察。
- 将载玻片避光保存于 4 °C，待成像时取出。
8. 成像与分析
- 使用共聚焦显微镜对染色样本进行成像。
注意： 在本实验方案中，使用了倒置光谱激光扫描显微镜（见材料表），并配备10x/NA 0.40或60x/NA 1.4物镜（用于细胞因子亚细胞定位分析）。各荧光染料和荧光蛋白的激发波长与发射波长详见材料表。
- 根据需要使用图像处理软件（如Imaris或Fiji）进行分析与定量。