从小鼠全血中纯化和活化血小板

摘要

来源：Narciso, M. G.，等。小鼠血液中血小板的纯化。J. Vis. Exp. (2019)。

在本视频中，我们介绍了一种从小鼠全血中纯化血小板并利用血小板激动剂凝血酶对其进行后续激活的实验方案。通过流式细胞术分析，纯化的静息状态血小板可根据其细胞表面标志物 CD41 的表达进行鉴定，而纯化的激活状态血小板则同时表达表面标志物 CD41 和 CD62P。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 血小板纯化

注意：血小板纯化应在室温下进行，以防止其降解。确保试剂和仪器的温度在18至22 °C之间。为防止血小板降解，操作过程中应避免快速移液和剧烈震荡。

1. 在1.5 mL离心管中加入600 µL碘海醇梯度介质（含12%碘海醇粉末、0.85%氯化钠、5 mM Tricine，pH 7.2）。
2. 使用宽口移液枪头，沿管壁缓慢将200 µL血液样本加至梯度介质上方，避免血液与碘海醇介质混合（图1A）。
3. 将含有样本的离心管在20 °C下以400 × g离心20分钟，使用水平转子，加速度和减速度均设为缓慢。
4. 使用宽口移液枪头收集大部分富血小板层及少量贫血小板层（总体积300至400 µL），注意不要扰动红细胞层和白细胞层（图1B）。将血小板样本转移至新离心管中。
   注意：若血液中血小板计数较低或使用血液体积较小，则富血小板层与贫血小板层可能合并为单一层次。
5. 向血小板样本中加入1 mL PBS，通过轻柔颠倒混匀，然后在20 °C下以800 × g离心10分钟（使用水平转子）。彻底弃去上清液，加入200 µL PBS，通过轻柔吹打重悬血小板。
   注意：此步骤为可选步骤，可去除梯度介质和血浆蛋白，提高血小板对凝血酶等激动剂的敏感性。由于不同离心机具有不同的程序设置，缓慢加/减速参数应参考离心机用户手册进行设定。
6. 取30 µL上述样本转移至新离心管中用于血小板计数。剩余血小板可用于生化和生理学检测，如血小板活化、聚集、颗粒释放等实验。
7. 如需进行RNA或蛋白质提取，将血小板样本在800 × g离心10分钟以沉淀血小板。彻底弃去上清液，注意不要扰动沉淀。加入适量体积的RNA或蛋白质裂解缓冲液以裂解血小板。

2. 血小板活化

1. 在离心管中，加入1至2百万个纯化的血小板，体积不超过100 µL的染色缓冲液（含2%胎牛血清的PBS）。
2. 对于多个样本，配制抗体主混合液，每种抗体各取1 µL（0.5 mg/mL），包括PE-Cy7标记的抗小鼠TER-119抗体、PE标记的抗小鼠CD45抗体、FITC标记的抗小鼠CD41抗体，以及APC标记的抗小鼠/人CD62P（P-选择素）抗体，分别用于检测红细胞、白细胞、血小板及活化血小板。将主混合液加入各离心管中以染色细胞。切勿加入凝血酶。
3. 在另一离心管中，加入1至2百万个纯化的血小板，体积不超过100 µL的染色缓冲液，并加入0.4 mM GPRP肽。随后加入凝血酶以活化血小板，并按照步骤2.2进行染色。
   注意：为防止血小板活化导致聚集或凝块形成，应在加入凝血酶前先将GPRP加入样本中。凝血酶浓度需优化，以实现良好的血小板活化效果。血小板活化后，在流式细胞术检测过程中事件计数会减少。
4. 作为阳性对照，在离心管中加入最多100 µL染色缓冲液和1 µL全血，并加入0.4 mM GPRP肽，随后加入凝血酶以活化血小板。作为阴性对照，在离心管中加入最多100 µL染色缓冲液和1 µL全血，但不加入凝血酶。按照步骤2.2对细胞进行染色。
5. 进行流式细胞术同型对照实验时，标记5个离心管，分别标注为未染色、PE-Cy7、PE、FITC和APC。向各标记管中加入100 µL染色缓冲液、1 µL血液及1 µL相应的抗体，以染色细胞。
6. 将样本在室温避光条件下孵育30分钟，完成染色。
7. 向每管中加入1 mL染色缓冲液洗涤样本，在室温下以800 × g离心5分钟。小心弃去上清液，避免扰动沉淀。
8. 向每管中加入300 µL染色缓冲液，轻柔混匀后转移至FACS管中。将染色后的样本避光保存，直至使用流式细胞仪进行分析。

结果

图1. 小鼠血液在使用碘海醇梯度介质离心前后的状态。 （A）若小心加入血液样本，碘海醇与血液在离心前会形成两个独立的层。左侧面板为示意图，右侧面板为实际图像。（B）全血与梯度介质离心后可见四个独立的层。左侧面板为各层的示意图，右侧面板为实际图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC 大鼠抗小鼠/人 CD62P<br/>（P-选择素）	Thermoscientific&nbsp;	17-0626-82&nbsp;	血小板活化标志物
Eppendorf 管	Fisher Scientific	14-222-166	离心用管
胎牛血清（FBS）&nbsp;	Invitrogen&nbsp;	26140079	染色缓冲液组分
FITC 大鼠抗小鼠 CD41&nbsp;	BD Biosciences&nbsp;	553848	血小板标志物
甘氨酰-脯氨酰-精氨酰-脯氨酸（GPRP）	EMD Millipore	03-34-0001	防止血小板凝块形成
1000 &mu;L 宽口移液器吸头	ThermoFisher Scientific&nbsp;	21-236-2C&nbsp;	转移血液和血小板样本
PE 大鼠抗小鼠 CD45	BD Biosciences	561087	白细胞标志物
PE-Cy7 大鼠抗小鼠 TER 119	BD Biosciences	557853	红细胞标志物
200 &micro;L 宽口移液器吸头	ThermoFisher Scientific	21-236-1A	转移血液和血小板样本
磷酸盐缓冲液（PBS）	ThermoFisher Scientific	14040-117	洗涤和稀释用缓冲液
染色缓冲液	本实验室制备	非目录产品	洗涤和稀释缓冲液
凝血酶	Enzyme Research Laboratory	HT 1002a	血小板活化激动剂
氯化钠&nbsp;	Sigma-Aldrich&nbsp;	S7653&nbsp;	生理盐水
台式离心机&nbsp;	ThermoFisher Scientific&nbsp;	75253839/433607&nbsp;	水平转子离心机
三（羟甲基）甲基甘氨酸（Tricine）&nbsp;	Sigma-Aldrich&nbsp;	T0377&nbsp;	Nycodenz 介质用缓冲液
FACS 管&nbsp;	Fisher Scientific&nbsp;	352008	流式细胞术用管