从小鼠全血中纯化和活化血小板

摘要

来源：Narciso, M. G.，等。小鼠血液中血小板的纯化。J. Vis. Exp. (2019)。

在本视频中，我们介绍了一种从小鼠全血中纯化血小板并利用血小板激动剂凝血酶对其进行后续激活的实验方案。通过流式细胞术分析，纯化的静息状态血小板可根据其细胞表面标志物 CD41 的表达进行鉴定，而纯化的激活状态血小板则同时表达表面标志物 CD41 和 CD62P。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 血小板纯化

注意：血小板纯化应在室温下进行，以防止其降解。确保试剂和仪器的温度在18至22 °C之间。为防止血小板降解，操作过程中应避免快速移液和剧烈震荡。

1. 在1.5 mL离心管中加入600 µL碘海醇梯度介质（含12%碘海醇粉末、0.85%氯化钠、5 mM Tricine，pH 7.2）。
2. 使用宽口移液枪头，沿管壁缓慢将200 µL血液样本加至梯度介质上方，避免血液与碘海醇介质混合（图1A）。
3. 将含有样本的离心管在20 °C下以400 × g离心20分钟，使用水平转子，加速度和减速度均设为缓慢。
4. 使用宽口移液枪头收集大部分富血小板层及少量贫血小板层（总体积300至400 µL），注意不要扰动红细胞层和白细胞层（图1B）。将血小板样本转移至新离心管中。
   注意：若血液中血小板计数较低或使用血液体积较小，则富血小板层与贫血小板层可能合并为单一层次。
5. 向血小板样本中加入1 mL PBS，通过轻柔颠倒混匀，然后在20 °C下以80....

结果

图1. 小鼠血液在使用碘海醇梯度介质离心前后的状态。 （A）若小心加入血液样本，碘海醇与血液在离心前会形成两个独立的层。左侧面板为示意图，右侧面板为实际图像。（B）全血与梯度介质离心后可见四个独立的层。左侧面板为各层的示意图，右侧面板为实际图像。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC 大鼠抗小鼠/人 CD62P<br/>（P-选择素）	Thermoscientific&nbsp;	17-0626-82&nbsp;	血小板活化标志物
Eppendorf 管	Fisher Scientific	14-222-166	离心用管
胎牛血清（FBS）&nbsp;	Invitrogen&nbsp;	26140079	染色缓冲液组分
FITC 大鼠抗小鼠 CD41&nbsp;	BD Biosciences&nbsp;	553848	血小板标志物
甘氨酰-脯氨酰-精氨酰-脯氨酸（GPRP）	EMD Millipore	03-34-0001	防止血小板凝块形成
1000 &mu;L 宽口移液器吸头	ThermoFisher Scientific&nbsp;	21-236-2C&nbsp;	转移血液和血小板样本
PE 大鼠抗小鼠 CD45	BD Biosciences	561087	白细胞标志物
PE-Cy7 大鼠抗小鼠 TER 119	BD Biosciences	557853	红细胞标志物
200 &micro;L 宽口移液器吸头	ThermoFisher Scientific	21-236-1A	转移血液和血小板样本
磷酸盐缓冲液（PBS）	ThermoFisher Scientific	14040-117	洗涤和稀释用缓冲液
染色缓冲液	本实验室制备	非目录产品	洗涤和稀释缓冲液
凝血酶	Enzyme Research Laboratory	HT 1002a	血小板活化激动剂
氯化钠&nbsp;	Sigma-Aldrich&nbsp;	S7653&nbsp;	生理盐水
台式离心机&nbsp;	ThermoFisher Scientific&nbsp;	75253839/433607&nbsp;	水平转子离心机
三（羟甲基）甲基甘氨酸（Tricine）&nbsp;	Sigma-Aldrich&nbsp;	T0377&nbsp;	Nycodenz 介质用缓冲液
FACS 管&nbsp;	Fisher Scientific&nbsp;	352008	流式细胞术用管