从小鼠曲细精管中分离免疫调节性塞尔托利细胞

摘要

来源：Bhushan, S. 等，大鼠睾丸中支持细胞与管周细胞的分离 J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了从小鼠睾丸的曲细精管中分离支持细胞的方法。通过酶消化和反复洗涤，可促进支持细胞释放到溶液中，随后可进一步培养以实现增殖和生长。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 培养基、酶溶液和动物的准备

1. 通过将1 g碘溶解于100 ml乙醇中，制备1%碘酒溶液。
2. 制备2份各500 ml的不含Ca²⁺ 和Mg²⁺ 的Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS），每份分别加入7.5 ml D-葡萄糖（100 g/L）和5 ml 100倍浓度的青霉素/链霉素储备液（终浓度为15 mg/ml D-葡萄糖、50 U/ml青霉素和50 µg/ml链霉素）。
3. 向1份500 ml的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基中加入5 ml 100倍浓度的青霉素/链霉素储备液（终浓度为50 U/ml青霉素和50 µg/ml链霉素）。
4. 通过将25 mg胰蛋白酶和0.1 ml DNase I（1 mg/ml DNase I）加入9.9 ml PBS中，配制胰蛋白酶-DNase I溶液（终浓度为2.5 mg/ml胰蛋白酶和10 µg/ml DNase I）。
5. 将50 mg胰蛋白酶抑制剂溶解于5 ml PBS中，配制胰蛋白酶抑制剂A溶液（10 mg/ml）；将25 mg胰蛋白酶抑制剂溶解于10 ml PBS中，配制胰蛋白酶抑制剂B溶液（2.5 mg/ml）。
6. 配制胶原酶-透明质酸酶-脱氧核糖核酸酶I（DNase I）溶液：将10 mg胶原酶A（终浓度1 mg/ml）、10 mg透明质酸酶（终浓度1 mg/ml）和0.1 ml DNase I（1 mg/ml DNase I）（终浓度10 µg/ml）溶解于10 ml PBS中。
7. 通过将10 mg透明质酸酶（终浓度1 mg/ml）和0.1 ml DNase I溶液（1 mg/ml）（终浓度10 µg/ml）加入9.9 ml PBS中，配制透明质酸酶-DNase I溶液。
8. 应准时订购Wistar大鼠，使其在进行支持细胞（Sertoli cell）分离当天恰好为19日龄。
   注意：本方案适用于10只大鼠，但可调整为最少5只、最多20只，所有溶液的体积需相应调整。
   在以下方案中，“移液管”指血清移液管。

2. 生精小管的制备

1. 将10只雄性Wistar大鼠逐只放入干燥器中，使用CO₂ 进行麻醉，气流速度应至少每分钟置换容器体积的20%。等待呼吸停止后，通过捏压足垫测试麻醉深度，若无反应，则通过颈椎脱位法对每只大鼠实施安乐死。在流动水下切断颈静脉和颈动脉（vagina carotica）以放尽血液，并用70%乙醇擦拭腹部进行消毒。
2. 用镊子将腹部皮肤与腹肌分离，剪取一块从耻骨联合延伸至胸骨的椭圆形皮肤瓣 （图1A） ，并将其向上翻至胸部。接着，夹住腹肌，从耻骨联合至胸骨做正中切口。
   1. 用拇指从骨盆向上挤压腹部，使睾丸从下骨盆推出。用镊子夹住附睾脂肪垫 （图1B） ，进一步拉出睾丸。剪断精索 （图1B），注意保持白膜完整，将所有睾丸收集于盛有20 ml PBS的50 ml锥形管中 （图1C）。
3. 收集全部睾丸后，加入等体积（20 ml）含1%（w/v）碘的乙醇溶液进行消毒。轻轻倒置管子两次，立即倾去上清液，并迅速用各25 ml PBS洗涤睾丸两次 （图1D）。
4. 将睾丸转移至含有15 ml PBS的培养皿中 （图1E）。用镊子牢固夹住每个睾丸的一端，在另一端的白膜上做一小切口，使用闭合的剪刀刀面作为刮取工具，挤出曲细精管。
   注意：曲细精管应仍保持紧凑的睾丸状团块，仅有少量管状结构伸入溶液中，以确保酶解过程均匀进行 （图1F）。
5. 将去被膜的睾丸转移至含有10 ml胰蛋白酶-DNase I溶液的100 ml螺口瓶中。在32 °C振荡水浴中进行消化（120次/分钟）。消化4分钟后，肉眼观察曲细精管是否开始分散。一旦曲细精管开始分散进入溶液，立即终止消化。如有必要，可继续孵育最多2分钟。
6. 加入5 ml胰蛋白酶抑制剂溶液A以终止胰蛋白酶消化。使用10 ml移液器上下吹打3–4次充分混匀溶液，然后转移至50 ml锥形管中。
7. 孵育5分钟后，观察曲细精管在重力作用下沉降，小心使用步骤2.6中的10 ml移液器吸除上清液，加入10 ml胰蛋白酶抑制剂B溶液以彻底终止胰蛋白酶消化。用移液器上下吹打2–3次重悬曲细精管。
8. 为去除污染的间质细胞，用各25 ml PBS对曲细精管进行9次洗涤。每次洗涤均使用25 ml移液器重悬曲细精管，并在重力作用下静置沉降10分钟。始终使用同一支25 ml移液器完成PBS添加、重悬及上清液移除操作。

3. 曲细精管周围细胞（PTCs）的去除/分离

1. 将所有小管转移至一个100 ml螺口瓶中，并加入胶原酶-透明质酸酶-DNase I溶液 (图2A)。在32 °C振荡水浴中消化10分钟（120次/分钟）。
2. 用移液器吸取一滴悬液滴加于载玻片上，立即在倒置光学显微镜下以100倍放大倍数检查小管。若消化程度不足，则继续孵育2分钟（显微镜检查所需时间不计入）。
   注意： 此步骤中所有小管长度会缩短，且小管边缘应变得粗糙 (图2B 和 C)。边缘粗糙表明已释放出管周细胞。
3. 使用步骤2.8中的25 ml移液器将含有消化后小管的悬液转移至一个50 ml锥形管中。用10 ml PBS冲洗100 ml瓶，并将洗涤液加入锥形管中的小管悬液中。静置10分钟，使消化后的小管依靠重力自然沉降，然后再次使用25 ml移液器小心吸除含有PTC的上清液，并转移至新的锥形管中。在吸除最后几毫升液体时，使用5 ml移液器，以防止小管被带出。

4. 支持细胞（SCs）的分离

1. 使用 25 ml 移液管将步骤 3.3 中沉淀的曲细精管充分重悬于 25 ml PBS 中，并在重力作用下静置沉降 12 分钟。使用同一支 25 ml 移液管进行 PBS 的移取、曲细精管的重悬以及上清液的去除。重复洗涤 3 次（共洗涤 4 次）。
2. 最后一次洗涤后，将消化后的曲细精管转移至另一个含有透明质酸酶-DNase I 溶液的 100 ml 螺口瓶中。在 32 °C 的摇水浴中进行消化（120 次/分钟振荡）。
3. 5 分钟后，按照步骤 3.2 的方法，在 100 倍光学显微镜下再次检查曲细精管。
   注意： 应可见短曲细精管、曲细精管聚集体以及释放的细胞 （图 2D）。
   1. 让曲细精管聚集体静置沉降 10 分钟，使用 25 ml 移液管吸除上清液。用 25 ml PBS 洗涤聚集体 4 次，每次洗涤沉降时间为 10 分钟 （图 2E）。
4. 加入 20 ml RPMI 1640 培养基，将悬液用安装在 20 ml 注射器上的 18 G 针头反复吹打 10 次。避免产生气泡。
   注意： 将悬液通过针头吸入和推出各算一次。通过流体动力剪切力破坏和均质化细胞是制备易聚集细胞的标准技术。细胞通过内径较小的皮下注射针头通常不会影响其功能特性。 图 3C 和 D 显示了培养第 4 天纯化支持细胞的正常超微结构。
   1. 取一滴悬液滴加在玻璃载片上，若聚集体已完全分散，则在倒置光学显微镜下以 10 倍物镜快速检查细胞常规培养状态 （图 2F）。将细胞悬液通过 70 µm 细胞筛，以获得滤液中的纯单细胞悬液。
5. 将步骤 4.4 的滤液在室温下以 200 × g 离心 10 分钟，不使用刹车。使用 25 ml 移液管小心吸除上清液，并将支持细胞重悬于 40 ml RPMI 1640 培养基（无血清）中。
6. 将 100 µl 细胞悬液与 100 µl 台盼蓝染液混合，使用改进型血细胞计数板（Neubauer Improved chamber）进行细胞计数。根据计数结果将细胞浓度调整为 3 × 10⁶ 个细胞/ml。每孔接种 1 ml 至 6 孔板中（= 第 1 天）。注意： 悬液中的支持细胞沉降迅速，因此每次用移液管取样前应短暂振荡混匀。至第 4 天，细胞将牢固贴附于基质表面。

结果

图 1. Wistar 大鼠的睾丸被切除并去囊。（A）通过纵向切口打开腹腔，如文中所述。星号（*）指示附睾脂肪垫。（B）通过切断精索取出睾丸，并（C）收集至含有 20 ml PBS 的 50 ml 锥形管中。收集完所有睾丸后，将其置于含 20 ml 1%（w/v）碘的乙醇溶液中进行消毒。为去除碘，用每份 25 ml 的 PBS 快速洗涤两次。（D）第一次 PBS 洗涤后的睾丸。（E）将睾丸转移至培养皿（右侧），如文中所述，用闭合的剪刀刀片（左侧）从切开的白膜中挤出曲细精管。（F）去囊后的睾丸仍保持致密的睾丸形状，部分单根小...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Corning™ 细胞滤筛 70 µm	Corning	431751	白色
DAPI 封片剂 ProLong® Gold 抗荧光淬灭剂	Life Technologies	P-36931
D-葡萄糖	Sigma	G8644	100 g/L
不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）	Gibco	14190-094
脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）	Roche	10104159001
牛睾丸来源透明质酸酶	Sigma	H3506
青霉素（5,000 U/mL）链霉素（5,000 µg/mL）	Gibco	15070-063	100 倍浓缩液
RPMI-1640 培养基	Gibco	21875-034	含 300 mg/L L-谷氨酰胺
猪胰蛋白酶	Sigma	T5266
台盼蓝染色液（0.4%）	Gibco	15250-061
大豆胰蛋白酶抑制剂	Sigma	T6522	Sigma 产品的价格明显低于此前使用的 Roche 公司 BPTI（抑肽酶）。
Wistar WU 大鼠	Charles River	N/A	实验当天应为 19 日龄。