从小鼠曲细精管中分离免疫调节性塞尔托利细胞

摘要

来源：Bhushan, S. 等，大鼠睾丸中支持细胞与管周细胞的分离 J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了从小鼠睾丸的曲细精管中分离支持细胞的方法。通过酶消化和反复洗涤，可促进支持细胞释放到溶液中，随后可进一步培养以实现增殖和生长。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 培养基、酶溶液和动物的准备

1. 通过将1 g碘溶解于100 ml乙醇中，制备1%碘酒溶液。
2. 制备2份各500 ml的不含Ca²⁺ 和Mg²⁺ 的Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS），每份分别加入7.5 ml D-葡萄糖（100 g/L）和5 ml 100倍浓度的青霉素/链霉素储备液（终浓度为15 mg/ml D-葡萄糖、50 U/ml青霉素和50 µg/ml链霉素）。
3. 向1份500 ml的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基中加入5 ml 100倍浓度的青霉素/链霉素储备液（终浓度为50 U/ml青霉素和50 µg/ml链霉素）。
4. 通过将25 mg胰蛋白酶和0.1 ml DNase I（1 mg/ml DNase I）加入9.9 ml PBS中，配制胰蛋白酶-DNase I溶液（终浓度为2.5 mg/ml胰蛋白酶和10 µg/ml DNase I）。
5. 将50 mg胰蛋白酶抑制剂溶解于5 ml PBS中，配制胰蛋白酶抑制剂A溶液（10 mg/ml）；将25 mg胰蛋白酶抑制剂溶解于10 ml PBS中，配制胰蛋白酶抑制剂B溶液（2.5 mg....

结果

图 1. Wistar 大鼠的睾丸被切除并去囊。（A）通过纵向切口打开腹腔，如文中所述。星号（*）指示附睾脂肪垫。（B）通过切断精索取出睾丸，并（C）收集至含有 20 ml PBS 的 50 ml 锥形管中。收集完所有睾丸后，将其置于含 20 ml 1%（w/v）碘的乙醇溶液中进行消毒。为去除碘，用每份 25 ml 的 PBS 快速洗涤两次。（D）第一次 PBS 洗涤后的睾丸。（E）将睾丸转移至培养皿（右侧），如文中所述，用闭合的剪刀刀片（左侧）从切开的白膜中挤出曲细精管。（F）去囊后的睾丸仍保持致密的睾丸形状，部分单根小.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Corning™ 细胞滤筛 70 µm	Corning	431751	白色
DAPI 封片剂 ProLong® Gold 抗荧光淬灭剂	Life Technologies	P-36931
D-葡萄糖	Sigma	G8644	100 g/L
不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）	Gibco	14190-094
脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）	Roche	10104159001
牛睾丸来源透明质酸酶	Sigma	H3506
青霉素（5,000 U/mL）链霉素（5,000 µg/mL）	Gibco	15070-063	100 倍浓缩液
RPMI-1640 培养基	Gibco	21875-034	含 300 mg/L L-谷氨酰胺
猪胰蛋白酶	Sigma	T5266
台盼蓝染色液（0.4%）	Gibco	15250-061
大豆胰蛋白酶抑制剂	Sigma	T6522	Sigma 产品的价格明显低于此前使用的 Roche 公司 BPTI（抑肽酶）。
Wistar WU 大鼠	Charles River	N/A	实验当天应为 19 日龄。