从人外周血单个核细胞中选择性分离 CD4+ Vδ1+ γδ T 细胞

摘要

来源：Welker, C., 等分离与 离体 Vδ1细胞培养⁺CD4⁺γδ T细胞，一种胸腺外的αβ T细胞前体 视频实验杂志 (2015).

本视频展示了一种基于磁性标记的方法，用于从人外周血单个核细胞（PBMCs）中分离低浓度的CD4⁺Vδ1⁺γδ T细胞亚群。通过联合使用FITC标记的抗Vδ1抗体、磁性抗FITC微珠以及包被了抗CD4抗体的超顺磁性微珠，可成功从PBMC群体中纯化出CD4⁺Vδ1⁺ T细胞。

方案

所有涉及人类受试者的研究程序均按照机构、国家及国际人类福祉指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核。

1. Vδ1 T 细胞的分离

1. 取 <1 × 10⁶ 分离淋巴细胞，用于初步流式细胞术（FACS）以确定Vδ1 CD4 T细胞的频率。
   注意： 该T细胞亚群的数量在不同个体间以及根据个体的免疫状态可能存在显著差异。通常情况下，约1%的T细胞为Vδ1。⁺ 约1-5%的Vδ1⁺ 细胞为CD4⁺.
   1. 用1 ml FACS缓冲液（含2% FCS和5 mM EDTA的PBS）重悬细胞。在660 × g离心2 min，弃去上清液。残留约100 µl FACS缓冲液即可用于后续染色。短暂涡旋混匀，加入5 µl Fc阻断试剂，在室温孵育5 min，以提高FACS染色的特异性。
   2. 将人源单克隆抗体直接加入细胞中，无需去除Fc阻断试剂。确保使用针对Vδ1（1:50）、CD3（1:50）、CD4（1:200）、CD8（1:200）和TCRαβ（1:25）的抗体对细胞进行染色。同时使用相应的免疫球蛋白同型对照。在4 °C避光条件下孵育细胞与抗体20分钟。
   3. 用1 ml FACS缓冲液重悬细胞（660 × g离心2 min），弃上清，用残留的缓冲液体....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	D8537
MACS 缓冲液	Miltenyi Biotec	130-091-222	使用前补充 BSA 并预冷
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	不强制要求来自此供应商
抗人 Vd1 FITC（克隆：TS8.2）	Thermo Scientific	TCR2730	不强制要求来自此供应商
抗人 CD3 PerCP（克隆：SK7）	BD BioSciences	345766	不强制要求来自此供应商或使用此荧光染料
抗人 TCRab PE（克隆：T10B9.1A-31）	BD BioSciences	555548	不强制要求来自此供应商或使用此荧光染料
抗人 CD4 VioBlue（克隆：MT466）	Miltenyi Biotec	130-097-333	不强制要求来自此供应商或使用此荧光染料
抗人 CD8 APC-H7（克隆：SK1）	BD BioSciences	641400	不强制要求来自此供应商或使用此荧光染料
Anti-FITC MultiSort 试剂盒	Miltenyi Biotec	130-058-701	效果优于 Anti-FITC MicroBeads
MS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-201	使用前预冷
MiniMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 阳性分离试剂盒	life technologies	11331D