从人外周血单个核细胞中选择性分离 CD4+ Vδ1+ γδ T 细胞

摘要

来源：Welker, C., 等分离与 离体 Vδ1细胞培养⁺CD4⁺γδ T细胞，一种胸腺外的αβ T细胞前体 视频实验杂志 (2015).

本视频展示了一种基于磁性标记的方法，用于从人外周血单个核细胞（PBMCs）中分离低浓度的CD4⁺Vδ1⁺γδ T细胞亚群。通过联合使用FITC标记的抗Vδ1抗体、磁性抗FITC微珠以及包被了抗CD4抗体的超顺磁性微珠，可成功从PBMC群体中纯化出CD4⁺Vδ1⁺ T细胞。

方案

所有涉及人类受试者的研究程序均按照机构、国家及国际人类福祉指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核。

1. Vδ1 T 细胞的分离

1. 取 <1 × 10⁶ 分离淋巴细胞，用于初步流式细胞术（FACS）以确定Vδ1 CD4 T细胞的频率。
   注意： 该T细胞亚群的数量在不同个体间以及根据个体的免疫状态可能存在显著差异。通常情况下，约1%的T细胞为Vδ1。⁺ 约1-5%的Vδ1⁺ 细胞为CD4⁺.
   1. 用1 ml FACS缓冲液（含2% FCS和5 mM EDTA的PBS）重悬细胞。在660 × g离心2 min，弃去上清液。残留约100 µl FACS缓冲液即可用于后续染色。短暂涡旋混匀，加入5 µl Fc阻断试剂，在室温孵育5 min，以提高FACS染色的特异性。
   2. 将人源单克隆抗体直接加入细胞中，无需去除Fc阻断试剂。确保使用针对Vδ1（1:50）、CD3（1:50）、CD4（1:200）、CD8（1:200）和TCRαβ（1:25）的抗体对细胞进行染色。同时使用相应的免疫球蛋白同型对照。在4 °C避光条件下孵育细胞与抗体20分钟。
   3. 用1 ml FACS缓冲液重悬细胞（660 × g离心2 min），弃上清，用残留的缓冲液体积进行FACS检测。
2. 将未用于FACS分析的细胞在300 g、8 °C条件下离心12分钟，沉淀细胞。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于每1×10⁶细胞60 µl MACS缓冲液中⁷ 细胞。每1 × 10⁶个细胞加入20 µl Fc阻断试剂⁷ 细胞并在 4°C 孵育 5 分钟。
3. 每1 × 10⁶个细胞加入10 µl FITC标记的抗人Vδ1抗体⁷ 将细胞直接加入细胞中，在4 °C避光孵育12分钟。
4. 用14 ml MACS缓冲液洗涤细胞（300 g，8 °C离心12 min）；完全弃去上清液，每1×10⁷个细胞用80 µl MACS缓冲液重悬⁷ 细胞
5. 取 1-2 x 10⁵ 细胞，并用100 µl FACS缓冲液稀释，以通过FACS分析验证标记效果。此步骤无需添加其他成分。确保Vδ1的荧光亮度具有足够差异^- 和 Vδ1⁺ 细胞。若未达到此状态，请重复步骤 1.3 和 1.4。
6. 每 1 × 10⁶ 个细胞加入 20 µl 抗 FITC 磁珠⁷ 将细胞加入剩余细胞中，充分混匀，在4 °C避光孵育15分钟。随后，使用至少10 ml MACS缓冲液洗涤细胞（在8 °C下以300 x g离心12分钟）。
7. 离心期间，将预冷的磁性柱置于磁架上，用500 µl MACS缓冲液平衡。
8. 将细胞重悬于 500 µl MACS 缓冲液中（当细胞数量高于 1 x 10⁶ 时）⁸，相应扩大此体积，并将细胞小心地加至柱上。收集含有 Vδ1 的流穿液^- 细胞
9. 用 500 µl MACS 缓冲液洗涤柱子三次，并将流出液再次收集到同一管中。注意，在向柱子中加入缓冲液前，必须确保储液室已排空。
10. 将柱子从磁力装置上取下，放入一个15 ml锥形管中。用1 ml MACS缓冲液迅速冲洗柱子，通过用力将推杆插入柱内完成冲洗。收集流出液至管中。
    注意：为了获得纯度 >98%时，通常需要用第二个层析柱重复步骤1.7–1.9。
11. 使用与之前相同的抗体组合（见1.1.2）通过FACS分析验证细胞纯度，并对细胞进行计数。

2. Vδ1CD4⁺ T 细胞的分离

1. 用涡旋振荡器重悬25 µl CD4磁珠 >30 秒。将1.5 ml反应管中的磁珠用1 ml MACS缓冲液洗涤（洗涤体积为制造商所示的最小用量），将反应管置于磁力架上1分钟。用小型移液器（200 µl）小心弃去上清液，并将磁珠重新悬浮于原始体积的MACS缓冲液中。
2. 沉淀 Vδ1⁺ 细胞（离心12分钟，300 × g），吸除上清液，并将所有Vδ1重新悬浮⁺ 将细胞加入500 µl MACS缓冲液中，然后转移到含有磁珠的离心管中。充分混匀，于4 °C孵育20分钟，期间持续旋转或倾斜。例如， 在旋转仪中。
3. 将含有细胞的离心管置于磁力架上2分钟。确保管盖内无残留物。
   注意CD4⁺ 细胞将结合磁珠并附着在试管靠近磁铁的一侧。
4. 小心打开管盖，同时保持离心管置于磁力架中，收集含有CD4的上清液^-Vδ1⁺ 细胞，使用小规模移液器。放置 CD4^-Vδ1⁺ 将细胞转入另一离心管，并将该管再次放入磁铁中，以避免目的细胞群中可能残留的CD4细胞或磁珠。
   1. 洗涤CD4^- 细胞用5 ml MACS缓冲液重悬（离心12分钟，300 × g），然后重悬至浓度为1 × 10⁷⁵ 每 100 µl 培养基中的细胞数。CD4^- 细胞在适宜条件下可被轻松培养。
5. 将装有CD4的试管放置⁺ 细胞离开磁场后，用500 µl MACS缓冲液重悬细胞，重新放入磁力装置中。重复步骤2.3–2.5两次，以获得更高的纯度。用移液器吸除上清液。
6. 重悬 CD4⁺ 100 µl 培养基（RPMI 1640，10% FCS，1% L-谷氨酰胺，1% 青霉素/链霉素）中的细胞，加入 10 µl 磁珠解离液。室温下持续倾斜孵育 45 分钟例如， 在旋转仪中。
7. 将细胞置于磁铁中1分钟。小心收集含有无磁珠Vδ1的上清液⁺CD4⁺ 使用小规模移液器处理细胞。
8. 在磁铁外，用100 µl培养基重悬磁珠，并重复步骤2.6和2.7两次，以获得更高数量的CD4细胞⁺ 细胞
9. 离心收集细胞（300 × g，12 min），用移液器彻底弃去上清液。将细胞重悬于新鲜的预热培养基中并计数。检测Vδ1细胞的纯度。⁺CD4⁺ 通过1.1.1-1.1.3步骤中所述的FACS分析对细胞进行检测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	D8537
MACS 缓冲液	Miltenyi Biotec	130-091-222	使用前补充 BSA 并预冷
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	不强制要求来自此供应商
抗人 Vd1 FITC（克隆：TS8.2）	Thermo Scientific	TCR2730	不强制要求来自此供应商
抗人 CD3 PerCP（克隆：SK7）	BD BioSciences	345766	不强制要求来自此供应商或使用此荧光染料
抗人 TCRab PE（克隆：T10B9.1A-31）	BD BioSciences	555548	不强制要求来自此供应商或使用此荧光染料
抗人 CD4 VioBlue（克隆：MT466）	Miltenyi Biotec	130-097-333	不强制要求来自此供应商或使用此荧光染料
抗人 CD8 APC-H7（克隆：SK1）	BD BioSciences	641400	不强制要求来自此供应商或使用此荧光染料
Anti-FITC MultiSort 试剂盒	Miltenyi Biotec	130-058-701	效果优于 Anti-FITC MicroBeads
MS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-201	使用前预冷
MiniMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 阳性分离试剂盒	life technologies	11331D