一种体外生成人中性粒细胞胞外诱捕网的技术

摘要

来源：Najmeh, S.，等。简化的人中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的分离与处理。 J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了一种 体外 生成和分离中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的技术。从中性粒细胞外周血中分离中性粒细胞，并用佛波醇肉豆蔻酸醋酸酯（PMA）刺激以产生NETs。在孵育过程中，中性粒细胞经历一种细胞死亡过程（NETosis），释放出由去浓缩的染色质与颗粒状细胞质蛋白混合组成的NETs。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. NET 的生成

1. 每30 ml中性粒细胞溶液中加入500 nM PMA进行刺激，并将细胞接种于带有20 mm网格的150 x 25 mm平底组织培养皿中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育4小时，以诱导NETosis发生。
2. 刺激4小时后，轻柔吸除并弃去培养基，保留贴附在底部的NETs和中性粒细胞层，切勿破坏该层。
3. 每皿使用总共15 ml不含Ca和Mg的冷PBS，通过移液枪将15 ml PBS直接加到培养皿底部，冲洗底部以完全脱离所有贴壁物质。
4. 收集每皿洗涤所得溶液（步骤1.3），置于15 ml锥形离心管中，在4 °C条件下以450 × g离心10分钟。中性粒细胞及任何残留细胞将形成沉淀，上清液则为无细胞的富含NETs的组分。
5. 将上清液分装至1.5 ml微量离心管中，在4 °C条件下以18,000 ×g离心10分钟，使所有DNA沉淀。
   注意：若常规离心机可达到此类高转速，则使用较大体积离心管更为简便且节省时间；否则需将上清液分装至小管中，以便使用高速微量离心机。
6. 弃去上清液，将所有获得的沉淀合并，并用预冷的PBS重悬，调整浓度至每100 μl PBS中含有2 × 10⁷个中性粒细胞。由此获得可用于后续实验的无细胞NET储备液。
7. 使用分光光度法或其他DNA定量工具测定所获样品中的DNA浓度。样品中适宜的DNA浓度应介于140 – 180 ng/μl之间。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不含氯化钙和氯化镁的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（PBS）改良型	Wisent	311-425-CL
含L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基	Wisent	350-000-CL	3% RPMI溶液通过在RPMI中添加3%胎牛血清制备
佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Alrdrich	P8139
胎牛血清（FBS）	Wisent	080-150
带20毫米网格的Integrid组织培养皿（150 × 25毫米）	Falcon	353025