从小鼠牙齿组织块中分离牙龈免疫细胞网络

摘要

来源：Dutzan, N. 等，牙龈免疫细胞网络的分离、表征与功能检测。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了从小鼠模型中分离牙龈免疫细胞网络的操作步骤。通过酶消化法将牙龈组织从附着的牙齿和骨组织上解离，再进行机械性消化，从而释放出牙龈中的免疫细胞。所获得的细胞可用于免疫学实验。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 提前准备

1. 配制完全培养基：RPMI 培养基中添加 2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/毫升青霉素、100 µg/mL 链霉素和 10% 胎牛血清（FBS）。
2. 配制 DNase 培养基：50 mL RPMI 培养基中加入 7.5 µg DNase（现配现用，全程置于冰上）。
3. 配制胶原酶-DNase 培养基：在 5 mL DNase 培养基中加入 3.2 mg/mL IV 型胶原酶（Collagenase Type IV）（现配现用，全程置于冰上）。
4. 将离心机预冷至 4 °C。
5. 将摇床培养箱预热至 37 °C。

2. 牙龈组织块的分离、解剖及细胞分离

1. 根据动物研究咨询委员会（ARAC）指南，将小鼠置于含有 CO₂ 的适当密闭舱内实施安乐死。
2. 打开胸腔和腹腔以暴露心脏和内脏器官。进行灌注时，在下腔静脉处做一切口，并使用带有27 G针头的3 ml注射器经左心室灌注3 ml PBS via。
3. 将小鼠身体和头部固定在垫子上，腹部朝上。
4. 用剪刀从口角向颈部方向剪开每一侧口唇联合，分离覆盖下颌和颈部区域的皮肤，暴露皮下组织和肌肉。解剖下唇以暴露下颌骨。
5. 在下门齿之间剪开，分离下颌骨两侧，并将每侧固定，以便进入口腔。
6. 观察并解剖腭部，使其与鼻腔分离。
7. 使用10号刀片进行解剖，取上颌和下颌磨牙区域及其周围牙龈组织（图1）。在第一磨牙前方和第三磨牙后方做垂直切口，并在牙龈边缘（牙齿周围白色组织环）做水平切口。
8. 将上颌和下颌骨组织块放入含有5 ml胶原酶/脱氧核糖核酸酶（Collagenase/DNase）的50 ml锥形管中（置于冰上保存）。
9. 在37°C摇床培养箱中孵育1小时，在孵育最后5分钟时加入50 µl 0.5 M EDTA。
10. 向含有组织的50 ml管中加入5 ml冷的DNase培养基，轻轻旋转混匀。
11. 将4块组织转移至培养皿中，并用500 µl DNase培养基覆盖。使用手术刀片，刀刃朝向牙龈和牙间区域，去除每块组织上的牙龈组织。
12. 将培养皿中的组织和培养基，以及解剖过程中使用的先前DNase培养基，通过70 µm细胞筛网转移至新的50 ml离心管中。用DNase培养基（3–5 ml）冲洗所有使用过的器械并过滤。
13. 使用无菌3 ml注射器的推杆，在筛网上研磨组织，同时用冷的DNase培养基（30至35 ml）过滤。
14. 用冷的DNase培养基冲洗细胞筛网。
15. 在4 °C下以314 x g 离心6分钟。
16. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 ml完全培养基中。
17. 使用自动细胞计数仪对细胞进行计数（预期细胞数量应在8 x 10⁵ 至1.2 x 10⁶ 之间，细胞活力>80%）。

结果

图1：小鼠牙龈组织的分离。 示意图展示了上颌骨解剖范围及用于牙龈组织分离的独立牙龈段。（B）小鼠上颌骨片段（磨牙区），标示出组织块解剖的轮廓及分离后的组织块。图（C）和（D）分别为上颌磨牙段牙龈组织的苏木精-伊红染色（H&E），其中牙龈组织轮廓清晰可见，（C）为低倍镜下图像，（D）为高倍镜下图像。图中标明了原始放大倍数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
精细剪刀	精细科学工具	14058-11
3号手术刀柄	精细科学工具	10003-12
10号手术刀片	精细科学工具	10010-00	无菌
碎屑镊	Integra Miltex	6-304
带普通斜面的针头 	BD Medical	305109	27G，12.7 mm 长度
Monoject 注射器	Covidien	8881513934	鲁尔锁接头，3 mL
PBS，pH 7.4	Life Technologies	10010-049	不含钙和镁
RPMI 1640	Lonza	12-167F	不含 L-谷氨酰胺
牛胰 DNase I	Sigma-Aldrich	DN25-1G
IV型胶原酶	Gibco (by Life technologies)	17104-019
胎牛血清	Gemini Bio-products	100-106
庆大霉素 50 mg/mL	Quality biological	120-098-661EA
青霉素-链霉素	Gibco (by Life technologies)	15140-122
L-谷氨酰胺	Gibco (by Life technologies)	25030-081
0.5 M EDTA，pH 8.0	Quality biological	351-027-721EA
50 mL 离心管	Corning	352070	聚丙烯材质，无菌
70 μM 细胞筛	Corning	352350
培养皿	Corning	351029	无菌