小鼠肺组织样本中巨噬细胞胞外诱捕网的表征

摘要

来源：Sharma, R.，等。利用共聚焦显微镜观察巨噬细胞胞外陷阱。J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们介绍了一种用于小鼠肺组织中巨噬细胞胞外诱捕网（METs）免疫染色及基于共聚焦显微镜的可视化检测方案。组织驻留型巨噬细胞通过表达巨噬细胞特异性的F4/80表面糖蛋白标志物进行鉴定，而METs则通过标记其相关分子基质金属蛋白酶9、瓜氨酸化组蛋白H3以及胞外染色质来实现可视化。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 肺组织样本

注意： 对于肺组织的体内研究，应在相关暴露后研究样本。本实验最相关的暴露因素是微生物感染，尤其是细菌。可用于本方法的小鼠品系包括 C57BL/6 或 BALB/c 小鼠，雄性，10 - 12 周龄，体重 25 - 30 g。

1. 处死小鼠， 通过 腹腔注射氯胺酮（400 mg/kg）和赛拉嗪（40 mg/kg）。使用手术镊和手术剪打开胸腔，暴露肺和心脏。
   1. 使用21号针头将预热的PBS注入右心室，灌流30秒以冲洗血管中的血液，随后将10 mL 2% PLP固定液注入右心室，持续灌流30秒。
   2. 用预热至42 °C的PBS冲洗开放的胸腔。用21号针头连接一段适当长度的0.8 mm导管插入气管，注入800 μL预热至42 °C的3%低熔点琼脂糖溶液。
   3. 用编织丝线（4.0 USP）结扎气管。将丝线环绕气管，在套管插入点下方不远处打结并固定 通过 一个简单的单结。为凝固琼脂糖，在肺周围加入冰冷的PBS。使用剪刀和钝性分离法将肺和心脏作为整体从胸腔中取出。分别取出每侧肺组织，随后在4 °C条件下用2% PLP或福尔马林固定16小....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠样本：一抗
山羊抗小鼠 MMP9	Abcam	AF909	10 µg/mL
兔抗小鼠 H3Cit（瓜氨酸 R26）	Abcam	AB5103	10 µg/mL
大鼠抗小鼠 F4/80	实验室自制（杂交瘤）	实验室自制	20 µg/mL
绵羊抗人 Anti-HNE /NE	Sapphire Bioscience	LS-B4244	25 µg/mL
小鼠抗人 PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 µg/mL
Super-frost plus 载玻片	Menzel	S41104A
Dapi-prolong gold	Molecular probes	P36931
二抗
鸡抗兔 AF 488	Life technologies	A-21441
鸡抗兔 AF 594	Life technologies	A-21442
鸡抗山羊 AF 594	Life technologies	a-21468
鸡抗小鼠 AF488	Life technologies	A-21200
驴抗绵羊 AF 594	Life technologies	A-11018
鸡抗小鼠 AF 647	Life technologies	A-21463
驴抗绵羊 AF 594	Life technologies	A-11016
同型对照
兔 IgG	实验室自制
小鼠 IgG1	BD Bioscience	550878
小鼠 IgG2a	BioLegend	400201
绵羊 IgG	实验室自制
显微镜
C1 共聚焦扫描显微镜	Nikon
FV1200 共聚焦扫描显微镜	Olympus
组织来源
来自墨尔本大学药理学系的小鼠肺组织。
培养基
RPMI	Sigma-Aldrich	r8758
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F0926
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G7513
其他试剂
多聚甲醛/高碘酸/赖氨酸（PLP）固定液	Sigma-Aldrich	27387
二甲苯	Sigma-Aldrich	214736
天然福尔马林	Sigma-Aldrich	42904
石蜡	Sigma-Aldrich	327204
氯胺酮	Sigma-Aldrich	K2753
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A2576
溶剂 3B	Hi-Chem	2026
盖玻片 12 mm	Sigma-Aldrich	S1815
盖玻片 60 × 24 mm	Sigma-Aldrich	C6875
小鼠
C57 黑 6	莫纳什动物研究平台（MARP）
BALB/c	MARP