小鼠肺组织样本中巨噬细胞胞外诱捕网的表征

摘要

来源：Sharma, R.，等。利用共聚焦显微镜观察巨噬细胞胞外陷阱。J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们介绍了一种用于小鼠肺组织中巨噬细胞胞外诱捕网（METs）免疫染色及基于共聚焦显微镜的可视化检测方案。组织驻留型巨噬细胞通过表达巨噬细胞特异性的F4/80表面糖蛋白标志物进行鉴定，而METs则通过标记其相关分子基质金属蛋白酶9、瓜氨酸化组蛋白H3以及胞外染色质来实现可视化。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 肺组织样本

注意： 对于肺组织的体内研究，应在相关暴露后研究样本。本实验最相关的暴露因素是微生物感染，尤其是细菌。可用于本方法的小鼠品系包括 C57BL/6 或 BALB/c 小鼠，雄性，10 - 12 周龄，体重 25 - 30 g。

1. 处死小鼠， 通过 腹腔注射氯胺酮（400 mg/kg）和赛拉嗪（40 mg/kg）。使用手术镊和手术剪打开胸腔，暴露肺和心脏。
   1. 使用21号针头将预热的PBS注入右心室，灌流30秒以冲洗血管中的血液，随后将10 mL 2% PLP固定液注入右心室，持续灌流30秒。
   2. 用预热至42 °C的PBS冲洗开放的胸腔。用21号针头连接一段适当长度的0.8 mm导管插入气管，注入800 μL预热至42 °C的3%低熔点琼脂糖溶液。
   3. 用编织丝线（4.0 USP）结扎气管。将丝线环绕气管，在套管插入点下方不远处打结并固定 通过 一个简单的单结。为凝固琼脂糖，在肺周围加入冰冷的PBS。使用剪刀和钝性分离法将肺和心脏作为整体从胸腔中取出。分别取出每侧肺组织，随后在4 °C条件下用2% PLP或福尔马林固定16小时。
   4. 将标本置于 PBS 中，4 °C 保存，直至进行组织切片。
2. 准备肺组织样本请按以下步骤操作。
   1. 将步骤1.1中切除的肺组织在室温下用10%中性缓冲福尔马林固定24小时。转移至75%乙醇中，并放入组织处理机中进行12小时程序（75%乙醇中2.5小时，无水乙醇中3小时，溶剂3B中3.5小时，石蜡中3小时）。
   2. 包埋于标准石蜡中，制成福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织块，室温保存。
      注意： 在此阶段，通常可将肺组织切片以制备标准载玻片。
   3. 使用切片机将福尔马林固定石蜡包埋的肺组织切片切成4-5 μm厚度，并置于带电荷的涂层载玻片上。
   4. 将封片剂滴加3滴于60 mm × 24 mm盖玻片（1.5号）上，将载玻片倒置在盖玻片上，挤出多余封片剂。用指甲油密封四周，室温保存。

2. 肺组织样本的制备与显微观察

1. 对FFPE肺组织样本进行脱蜡、水化，并用抗原修复液进行预处理。
   1. 将FFPE切片在60 °C的烘箱中干燥60分钟，然后将切片置于二甲苯溶液中30分钟，再转移至70%乙醇溶液中，室温下处理5分钟。用自来水冲洗。
   2. 将切片置于耐热塑料膜中，在压力锅中使用HIER抗原修复法，于10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA、pH 9.0溶液中加热10分钟。冷却20分钟。在摇床上用自来水洗涤两次，每次5分钟，再在摇床上用PBS洗涤一次。
   3. 用含10%鸡血清的5% BSA/PBS溶液在室温下封闭30分钟。
2. 对组织进行染色。
   1. 为鉴定巨噬细胞中的METs，将一抗（MMP-9、H3Cit和F4/80）以1/100稀释度溶于1% BSA/PBS中，在4 °C孵育16小时（抗体用量的具体信息见材料表）。在摇床上用PBS洗涤两次，每次5分钟。
   2. 加入相应的二抗（溶于1% BSA/PBS中），室温孵育40分钟，实现荧光检测。所用抗体为：（1）鸡抗小鼠488（绿色），（2）鸡抗山羊594（红色），（3）驴抗小鼠647（远红）。
   3. 用PBS洗涤切片，然后使用含DAPI的封片剂封片，以进行染色质染色。
3. 使用倒置显微镜连接的共聚焦激光扫描头获取荧光图像。
   1. 使用405、488、561和647 nm激光激发样本。通过点击逐线扫描和调平按钮（2次线平均），使用20X 0.1 NA空气物镜和40X 1.0 NA油镜采集单层512 x 512像素的图像。
   2. 每张切片至少采集十个视野用于分析和结果数据（即，对照组10个高倍视野（HFOV），刺激样本组10个，依此类推，每只小鼠均如此）。
      注意：为获得具有代表性的全视野样本，可采用矩阵系统，将视野划分为不同区域，并对每个不同样本使用相同的矩阵选择视野（例如，将视野分为9个区域，从中心和四个角各取两个高倍视野）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠样本：一抗
山羊抗小鼠 MMP9	Abcam	AF909	10 µg/mL
兔抗小鼠 H3Cit（瓜氨酸 R26）	Abcam	AB5103	10 µg/mL
大鼠抗小鼠 F4/80	实验室自制（杂交瘤）	实验室自制	20 µg/mL
绵羊抗人 Anti-HNE /NE	Sapphire Bioscience	LS-B4244	25 µg/mL
小鼠抗人 PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 µg/mL
Super-frost plus 载玻片	Menzel	S41104A
Dapi-prolong gold	Molecular probes	P36931
二抗
鸡抗兔 AF 488	Life technologies	A-21441
鸡抗兔 AF 594	Life technologies	A-21442
鸡抗山羊 AF 594	Life technologies	a-21468
鸡抗小鼠 AF488	Life technologies	A-21200
驴抗绵羊 AF 594	Life technologies	A-11018
鸡抗小鼠 AF 647	Life technologies	A-21463
驴抗绵羊 AF 594	Life technologies	A-11016
同型对照
兔 IgG	实验室自制
小鼠 IgG1	BD Bioscience	550878
小鼠 IgG2a	BioLegend	400201
绵羊 IgG	实验室自制
显微镜
C1 共聚焦扫描显微镜	Nikon
FV1200 共聚焦扫描显微镜	Olympus
组织来源
来自墨尔本大学药理学系的小鼠肺组织。
培养基
RPMI	Sigma-Aldrich	r8758
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F0926
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G7513
其他试剂
多聚甲醛/高碘酸/赖氨酸（PLP）固定液	Sigma-Aldrich	27387
二甲苯	Sigma-Aldrich	214736
天然福尔马林	Sigma-Aldrich	42904
石蜡	Sigma-Aldrich	327204
氯胺酮	Sigma-Aldrich	K2753
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A2576
溶剂 3B	Hi-Chem	2026
盖玻片 12 mm	Sigma-Aldrich	S1815
盖玻片 60 × 24 mm	Sigma-Aldrich	C6875
小鼠
C57 黑 6	莫纳什动物研究平台（MARP）
BALB/c	MARP