制备抗原-佐剂乳剂以诱导自身免疫性脑脊髓炎

摘要

来源：Bäckström, B. T. 一种快速、简单且标准化的匀浆方法，用于制备抗原/佐剂乳剂以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了一种高效的均质化技术，用于制备抗原-佐剂乳剂，以在小鼠模型中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。该乳剂的水相中含有自身抗原——髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG），周围由包含灭活病原菌的连续油相包裹。该乳剂可实现抗原的持续释放，从而引发持久的免疫反应。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

注意： 该方法的示意图流程见图1。

1. 材料准备

注意：所有试剂均需在无菌操作台内无菌配制，并分装后按指定温度保存。试剂可保存长达两年而不失活。

1. 制备含 20 mg/mL 的 CFA 结核分枝杆菌 如下所述。
   1. 加入100 mg冻干粉 M. tuberculosis H37RA（参见 材料清单）以及五个3.2 mm钢珠加入一个7 mL离心管中（见 材料表）。在均质器中振荡试管（参见 材料表) 在最高转速（5,000 rpm）下离心60秒。
   2. 加入5 mL不完全弗氏佐剂（IFA）至试管中，以最高速度再次振荡60秒。转移匀浆后的悬浮液 M. tuberculosis 用移液器将IFA（现称为CFA）转移至新离心管中，留下磁珠，4 °C保存备用。
2. 向MOG的冻干粉中加入超纯水_35-55 肽（参见 材料表）以获得终浓度为10 mg/mL的肽溶液。通过0.2 µm滤器过滤除菌。分装为60 µL每份，于-20 °C保存备用。
   注意： MOG_35-55 本实验所用的肽纯度为免疫级（~70%），经三氟乙酸（TFA）切割，易溶于水，并含有C端酰胺（-NH₂）₂以增强 体内 稳定性。肽类分装样品从未解冻和再冷冻超过两次，并在使用前储存在 -20 °C。

2. CFA/多肽乳剂的制备

1. 计算免疫接种所需的乳剂用量。在此标准方案中，每只小鼠接种 50 µg MOG_35-55 肽和 300 µg 分散于弗氏完全佐剂（CFA）中的 M. tuberculosis。用于制备乳剂的各试剂（MOG_35-55 肽、PBS、CFA 和 IFA）所需用量可使用 补充文件 1 进行计算。为补偿乳剂在操作过程中的少量损失，计算时额外增加 20% 的试剂用量。
   注意： 本研究中使用的商用乳剂试剂盒（见 材料表）包含一个带螺帽和推杆的管子，封装于无菌袋中。每个乳剂试剂盒的管子最大容量为 9.6 mL，可制备 8 支 1 mL 注射器的乳剂，足够免疫 40 只小鼠（若每只动物使用 100 µL 乳剂，则可免疫 80 只小鼠）。
2. 将商用乳剂试剂盒中的螺帽管及待用试剂置于冰上。
3. 按照步骤 2.1 计算出的体积，依次向管中加入乳剂组分：PBS，然后是肽，接着是含 M. tuberculosis 的 CFA，最后是 IFA。
4. 将管盖拧紧后，反复拧紧和松开数次以确保密封。用手剧烈振荡管子 5–10 秒，初步混匀试剂。
5. 将管子放入振荡式匀浆仪中，并用固定杆固定。将速度调至最高档，时间设为 60 秒。运行结束后，将管子放回冰上静置 3 分钟。以相同设置重复运行一至两次。
6. 以 300 × g 离心 1 分钟，以去除夹带的空气并压缩乳剂。
7. 取下管盖，将推杆插入管中，缓慢下推至乳剂顶部。通过旋转拧下管子底部的可折断封口。
8. 取下注射器（1 mL；见 材料表）的推杆，并在注射器上安装针头（建议使用 25–27 G 针头）。
9. 将注射器后端连接至管子底部的专用卡口，并短促旋转锁定。
10. 轻轻推动推杆，将乳剂从管子转移至注射器中。当乳剂达到注射器 0.15 mL 刻度时停止。
11. 将注射器从管子上分离，小心插入推杆，注意避免空气进入注射器。推动推杆直至乳剂从针头流出。
    注意： 此时可取少量乳剂用于质量控制（见步骤 3）。
12. 对管中剩余的乳剂重复步骤 2.8–2.11。
    注意： 为尽量减少昂贵的 CFA/抗原乳剂的浪费，应使用 1 mL 注射器。也可使用其他适配管子底部专用卡口的注射器；但可能需要制备更大体积的乳剂。CFA/MOG_35-55 肽乳剂在 4 °C 下可保存长达 15 周，且不影响其诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的能力。

3. 乳剂的质量控制

1. 滴落测试：将少量乳液滴入装有 20 mL 冷水的无菌 50 mL 锥形管中。盖紧管盖，手动振荡数秒钟。若出现细小且彼此分离的液滴，则表明已形成水包油乳液。
2. 使用相差显微镜观察乳液。
   1. 为分析水包油颗粒的尺寸，取少量乳液（2–3 µL）滴加至显微镜载玻片上，用盖玻片涂抹开，然后用力以圆形轨迹按压，使乳液展平。
   2. 在相差显微镜（见材料表）下以 400 倍放大倍数观察涂布后的乳液，聚焦于呈现单层结构的视野区域，确保可见细小且均一的灰/白色颗粒（图 2A）。

结果

图1：使用商用乳剂试剂盒制备乳剂过程的示意图。 本图经Topping等人许可重新使用。

图 2：使用不同方法制备的乳剂的表征。（A）三种不同制备方法的代表性图像：标准均质法、传统注射器法和涡旋法。取少量乳剂置于载玻片上，在相差显微镜下观察（400倍）。比例尺 = 50 µm。每种方法展示的是来自>15次实验中的代...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	B. Braun	9166017V
1 mL 注射器	Sigma-Aldrich	Z683531
7 ml 带盖空管	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	7 mL 管
50 mL 无菌离心管	Fisher Scientific	10788561	50 mL 管
分散剂，轻质矿物油	Sigma-Aldrich	M8410	室温保存
乳化试剂盒	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	包含管、盖和推杆
不完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5506	4 °C 保存
<em>Mycobacterium tuberculosis</em>, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	4 &deg;C 保存
Minilys-个人匀浆仪	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	振荡匀浆仪
MOG<sub>35-55</sub> 肽	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	经 FDA 批准的油性佐剂
Pall Acrodisc 注射式滤器，0.2 &mu;m	Fisher Scientific	17124381	无菌滤器
PBS，不含 Ca<sup>2+</sup>/Mg<sup>2+</sup>	Thermo Fisher Scientific	14190144	PBS
相差显微镜	Olympus	BX40-B
3.2 mm 钢珠	Fisher Scientific	NC0445832	高压灭菌后室温保存