活体成像观察γδ上皮内淋巴细胞

摘要

来源：Jia, L., 等. 小鼠小肠上皮内淋巴细胞的活体成像. J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用共聚焦显微镜在转基因小鼠中可视化γδ型上皮内淋巴细胞（IELs）。手术过程包括创建穿孔线并进行纵向切口，以暴露肠黏膜和绒毛。这些转基因小鼠仅在γδ IELs中表达报告蛋白，从而实现对这些细胞的追踪。活体成像捕捉到绿色荧光标记的γδ IELs沿肠上皮细胞基底膜的动态运动过程。

方案

所有涉及动物模型的实验步骤均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠准备

注意：以下操作步骤，包括动物准备和手术，将耗时30–40分钟。手术前，请打开显微镜，并将显微镜上的封闭式培养箱预热至37 °C。

1. 使用来自 Bernard Malissen（法国巴黎 INSERM）的C57BL/6背景的8–10周龄TcrdEGFP小鼠进行实验。根据IACUC批准的操作规程，根据动物体重通过腹腔注射给予氯胺酮（120 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）以麻醉小鼠。通过呼吸频率（55–65次/分钟）、脚趾夹捏反应以及眼睑反射来评估麻醉深度。
2. 一旦达到外科手术麻醉水平，使用胶带将小鼠后肢固定在加热垫上以维持体温，并可通过直肠温度计监测体温。若出现麻醉减退迹象（例如呼吸频率增加、眨眼和/或眼睑反射引起的眼肌抽搐），则每次追加注射50 μL氯胺酮/赛拉嗪混合液，直至小鼠完全镇静。
3. 通过将50 µL Hoechst 33342（10 mg/mL）与315 µL 0.9%生理盐水混合来配制核染料；最终剂量根据小鼠体重为37.5 mg/kg（总体积约为200 µL）。小鼠麻醉成功后，使用结核菌素注射器经眶后静脉窦缓慢注射Hoechst染料。
   注意：注射后等待1–2分钟再进行下一步操作，以便小鼠适应眶后注射引起的循环血量变化。
4. 在眼睛表面涂抹少量润滑剂，防止角膜干燥。

2. 小鼠手术：剖腹术暴露肠黏膜

1. 沿下腹部正中线做一条2 cm的纵向切口，切开皮肤和腹膜，以暴露需要成像的肠段区域。
2. 使用弯头镊子小心地将盲肠从腹腔中拉出，并确定需要成像的小肠区域。操作过程中注意避免撕裂肠系膜血管。为尽量减少可能的损伤或出血，切勿用镊子抓取或夹捏肠管。
3. 选择一段适合成像的小肠区域（2–3 cm），该区域应含有最少的粪便内容物。小心地将盲肠和其余小肠还纳至腹腔内，同时保持目标肠段处于体外暴露状态。
   注意： 此步骤中应避免穿刺盲肠或破坏肠系膜血管系统。
4. 在肠系膜血管之间的下方组织两侧各放置一对镊子，轻轻摩擦镊尖以在膜上制造一个小孔（图1）。此孔可使缝合针在关闭腹腔时穿过肠管下方的肠系膜。
5. 在保持肠段外露的同时关闭腹膜切口。使用弯头镊子和连接于5 cm缝线的弯曲锥形针，从腹膜一侧穿入，穿过上一步制造的孔，再从腹膜另一侧穿出。在切口顶部和底部附近各缝合一针。
   注意： 此步骤中应避免损伤血管系统。
6. 重复上述操作，关闭肠段下方的皮肤切口：在切口中间位置缝合一针，位于腹膜层已缝合的两针之间。
   注意： 仅将需要成像的区域外置至关重要，这将减少成像过程中的额外移动。务必避免结扎肠系膜动脉。
7. 使用电灼仪沿对系膜缘进行一系列穿孔。电灼后立即在肠表面滴加数滴水，以防止热损伤进一步加重组织损害。用Kimwipe纸轻轻吸干残留水分。
8. 使用Vannas剪刀在灼烧组织的远端边缘剪开一个小的横向切口，然后沿灼烧线向暴露肠段的近端方向剪开（长度约1.5 cm），以暴露黏膜面。
   注意： 如有必要，可用镊子轻轻清除暴露黏膜表面残留的多余粪便内容物。
9. 用湿润的Kimwipe纸覆盖小鼠腹部，防止组织脱水。将小鼠置于密闭容器中转运至显微镜处。

3. 采用旋转盘共聚焦显微镜进行图像采集

1. 用移液器将150 µL浓度为1 µM的AlexaFluor 633 HBSS溶液滴加到35 mm培养皿的玻璃盖玻片底部。调整小鼠位置，使其暴露的黏膜表面直接接触盖玻片。
2. 将显微镜头部向后倾斜，将小鼠放置在成像载物台上的盖玻片培养皿中，并置于预热的培养箱内。或者，可用加热毯覆盖小鼠以维持其体温。
3. 启动成像软件。为避免光漂白并最小化时间点之间的间隔，每种激光的激发强度和曝光时间分别不应超过10–15 mW或120–150 ms。将帧平均值设为“2”，并开启EM增益功能以降低背景噪声。选择63倍物镜校准，以确保像素尺寸的准确测量。
   注意： 上述设置旨在提供初始参考，具体参数将根据各台显微镜的配置有所不同。
4. 使用405 nm激光和20倍空气物镜，观察细胞核以定位一片无明显运动或漂移的绒毛区域。避免因呼吸、蠕动或心跳引起伪影运动的区域。
5. 使用XY扫描功能记录目标区域的XY坐标，然后切换至甘油浸没式63倍物镜。
6. 通过在405 nm通道获取长达1分钟的实时图像，确认所选视野中的绒毛处于稳定状态。
7. 在405 nm通道获取实时图像的同时，调节焦距以找到绒毛尖端正下方的正交平面。从绒毛尖端上皮下方开始，沿绒毛向下采集Z轴层扫图像，直至难以分辨细胞核为止（约15–20 µm），步长为1.5 µm。
   注意： 当使用上述曝光时间对三个通道（405、488、640 nm）进行成像时，可依次以约20秒的时间间隔采集全部三个通道的图像。
8. 在开始采集后3–5分钟，以分析模式打开软件，确认图像稳定性及γδ IEL的运动性。对每片绒毛区域持续采集图像30–60分钟。每只小鼠记录2–3个视野。成像过程中，每5分钟监测一次小鼠状态。

结果

图1：使用镊子在肠系膜上打孔。 将镊子置于膜的两侧，以创建用于缝合线的孔。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 培养皿，No. 1.5 盖玻片	MatTek	P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 肼	Invitrogen	A30634
BD PrecisionGlide 皮下注射针头 - 27G	Thermo Fisher Scientific	14-826-48
BD Slip Tip 无菌注射器 - 1 ml	Thermo Fisher Scientific	14-823-434
BD 结核菌素注射器	Thermo Fisher Scientific	14-829-9
解剖剪刀	Thermo Fisher Scientific	08-940
电灼器	Thermo Fisher Scientific	50822501
封闭式培养腔	OKOLAB		显微镜
眼科针，#3 号；1/2 圆弧，锥形尖端，12 mm 弦长	Roboz	RS-7983-3
Hank's 平衡盐溶液	Sigma-Aldrich	55037C
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
倒置 DMi8	Leica		显微镜
氯胺酮	Putney		麻醉剂
Kimwipes 纸巾	VWR	21905-026
McPherson-Vannas 剪刀 3" (7.5 cm) 长，5×0.15 mm 直头锐利	Roboz	RS-5600
不可吸收外科缝线，丝线卷轴，黑色编织	Fisher Scientific	NC0798934
Nugent 镊子 4.25" (11 cm) 长，弯头光滑，1.2 mm 尖端	Roboz	RS-5228
Puralube Vet 软膏	Dechra		润滑眼膏
Yokogawa CSU-W1 转盘共聚焦系统，配备 63× 1.3 数值孔径 HC PLAN APO 甘油浸没物镜、iXon Life 888 EMCCD 相机、405 nm 半导体激光器、488 nm DPSS 激光器、640 nm 半导体激光器	Andor		共聚焦系统
赛拉嗪	Akorn		麻醉剂